سبد خرید شما
Fa   En

برای شما

پشتیبانی

تماس با پشتیبانی

شبکه های مجازی

  • اینستاگرام
  • تلگرام
  • ایتا

ROX در تکنیک qPCR چیست؟

RoX (رنگ مرجع، همچنین به عنوان ROX یا رنگ مرجع غیرفعال شناخته می شود) اغلب در ریل تایم PCR به عنوان رنگ مرجع برای عادی سازی سیگنال های فلورسانس استفاده می شود. این یک رنگ غیر فلورسنت است که در محدوده رنگ گزارشگر مورد استفاده برای تشخیص آمپلیکون هدف، فلورسانس منتشر نمی کند. در Real-time PCR، RoX معمولاً همراه با پرایمرها، الگوی DNA و رنگ گزارشگر به مخلوط واکنش PCR اضافه می شود. این به عنوان یک مرجع غیرفعال برای نظارت بر کارایی واکنش و تشخیص هرگونه تغییر در سیگنال فلورسانس ناشی از عواملی مانند خطاهای پیپت، خاموش شدن رنگ، یا تنوع ابزار عمل می کند. با استفاده از RoX به عنوان رنگ مرجع، محققان می توانند سیگنال های فلورسانس رنگ گزارشگر را برای محاسبه هرگونه تغییر در شرایط واکنش نرمال کنند. این به بهبود دقت و قابلیت اطمینان نتایج PCR ریل تایم کمک می کند. RoX یک جزء ضروری در سنجش زمان واقعی PCR برای اطمینان از صحت داده‌ها و تکرارپذیری آزمایش‌ها است. علاوه بر این، RoX همچنین می تواند برای نظارت بر یکنواختی چرخه حرارتی در طول فرآیند تقویت PCR استفاده شود. با اندازه‌گیری فلورسانس منتشر شده توسط RoX، محققان می‌توانند سازگاری مراحل گرمایش و سرمایش در ترموسایکلر را ارزیابی کنند، که برای به دست آوردن نتایج PCR ریل تایم قابل اطمینان و قابل تکرار بسیار مهم است.

نرمالیزه کردن و عیب یابی واکنشهای qPCR

طی فرآیند PCR، سطح فلورسانس ROX، که یک رنگ مرجع غیرفعال فلورسنت است ثابت باقی می‌ماند. وقتی داده‌های qPCR با استفاده از ROX نرمال شوند، تاثیر اختلافات چاهک به چاهک مانند تغییرات مقدار تراکم، تابش ناهمسان و تغییرات جزئی در اپتیک  کاهش می‌یابد. در اکثر ابزارهای PCR بلادرنگ برای نرمال سازی این منبع و سایر منابع اختلاف ایجاد کننده در نتایج، از ROX استفاده می‌شود. از آنجا که ROX بر فرآیند PCR یا طیف انتشار سایر رنگ‌های خاموش کننده و گزارشگر TaqMan تأثیر نمی‌گذارد، رنگ مرجع غیرفعال ترجیحی محسوب‌می‌شود.

ویژگیها

ویژگی‌های رنگ مرجع غیرفعال ROX عبارتند از: نرمال سازی نوسانات فلورسانس غیرمرتبط با PCR- با نرمال کردن داده‌ها توسط یک مرجع غیرفعال مانند رنگ ROX، تکرارها را می‌توان با دقت بیشتری تراز کرد. اگر نرمال سازی انجام نشود، برای رسیدن به همان سطوح دقت، تکرارهای بیشتر و در واقع زمان و منابع بیشتری برای هر اجرا نیاز است. هنگام استفاده از داده‌هایی که با رنگ ROX نرمال شده‌اند، محققان می‌توانند با حفظ قدرت آماری از تکرارهای کمتری استفاده‌کنند زیرا این داده‌ها بسیار دقیق‌تر از داده غیرنرمالیزه است.

تهیه یک خط پایه پایدار برای PCR کمّی چندگانه و RT-PCR

در یک نمودار یا پلات چند جزئی، سیگنال ROX باید در طول فرآیند qPCR ثابت بماند. هر گونه رویداد غیرمرتبط با PCR منجر به اسپایک، افت یا سایر رفتارهای غیرعادی در سیگنال‌های ROX و گزارشگر می‌شود.

استفاده از رنگ ROX برای عیب یابی مشکلات رایج در qPCR

برای نرمال‌سازی در برابر متغیرهای متعددی که باعث تغییرات چاهک به چاهک می‌شوند می‌توان از رنگ‌های مرجع غیرفعال استفاده‌کرد. بر خلاف رنگ‌های مرتبط با پروب که امکان شناسایی یک یا چند هدف را در یک چاهک فراهم می‌کنند، این رنگ تحت‌تأثیر فرآیند PCR قرار نمی‌گیرد.

بیشتر بخوانید:لدر چیست؟

منابع رایج خطاهای فرآیند که میتوانند دادههای شما را به خطر بیندازند:

-وجود حباب در چاهک

-تبخیر

-متراکم شدگی یا قطرات

-مشکلات ابزاری مانند نوسانات الکتریکی

نظارت بر فلورسانس ROX در یک پلات چند جزئی، محققان را قادر می‌سازد تا مسائل مختلف کنترل کیفی را در اجرای qPCR شناسایی کنند. برای عیب یابی داده‌ها با استفاده از پلات چند جزئی، شکل سیگنال رنگ ROX را بررسی کنید:

اگر خوانش رنگ راکس در طول اجرا مسطح ماند،  نتیجه مورد انتظار: فلورسنس راکس باید در طول مدت واکنش ثابت بماند زیرا تحت تاثیر فرایند تکثیر قرار نمی گیرد. اگر در طول اجرا افزایش یافت، ممکن است تبخیر رخ داده باشد زیرا با کاهش حجم، غلظت راکس افزایش می یابد. اگر دچار اسپایک یا افت لحظه ای شد، تغییرات ناگهانی باعث اختلال در ضبط داده ها در آن چاهک می شود، مانند حباب های هوا یا نوسانات الکتریکی.

کلام آخر

به طور خلاصه، RoX یک ابزار ارزشمند در ریل تایم PCR برای عادی سازی سیگنال های فلورسانس، تشخیص تغییرات در شرایط واکنش، و نظارت بر عملکرد سیکلر حرارتی است. استفاده از آن به اطمینان از دقت و قابلیت اطمینان آزمایش‌های PCR ریل تایم کمک می‌کند و آن را به یک جزء ضروری در تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی تبدیل می‌کند. جهت دریافت مشاوره و خرید انواع دستگاه ها و محصولات مولکولی با کارشناسان ما در ماناتک تماس حاصل فرمایید.

0 0 رای ها
امتیازدهی به مقاله
اشتراک در
اطلاع از
guest
0 نظرات
بازخورد (Feedback) های اینلاین
مشاهده همه دیدگاه ها
Fa En