ROX در تکنیک qPCR چیست؟

تکنیک qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) یا PCR واقعی زمانی (Real-Time PCR) یک روش بسیار حساس و دقیق برای تشخیص و کمی‌سازی توالی‌های خاص DNA و RNA است. یکی از اجزای کلیدی در این تکنیک، استفاده از رنگ‌های فلورسانس مانند ROX (رودامین X) است. رنگ ROX به عنوان یک مرجع پسیو عمل می‌کند و در فرآیند qPCR برای کنترل کیفیت و نرمال‌سازی داده‌ها استفاده می‌شود. این مقاله به بررسی کاربردها و اهمیت رنگ ROX در تکنیک qPCR می‌پردازد. RoX (رنگ مرجع، همچنین به عنوان ROX یا رنگ مرجع غیرفعال شناخته می شود) اغلب در ریل تایم PCR به عنوان رنگ مرجع برای عادی سازی سیگنال های فلورسانس استفاده می شود. در Real-time PCR، RoX معمولاً همراه با پرایمرها، الگوی DNA و رنگ گزارشگر به مخلوط واکنش PCR اضافه می شود.

این رنگ برای نظارت بر کارایی واکنش و تشخیص هرگونه تغییر در سیگنال فلورسانس ناشی از عواملی مانند خطاهای پیپت، خاموش شدن رنگ، یا تنوع ابزار عمل می کند. با استفاده از RoX به عنوان رنگ مرجع، محققان می توانند سیگنال های فلورسانس رنگ گزارشگر را برای محاسبه هرگونه تغییر در شرایط واکنش نرمال کنند. این به بهبود دقت و قابلیت اطمینان نتایج PCR ریل تایم کمک می کند. RoX یک جزء ضروری در سنجش زمان واقعی PCR برای اطمینان از صحت داده‌ها و تکرارپذیری آزمایش‌ها است. علاوه بر این، RoX همچنین می تواند برای نظارت بر یکنواختی چرخه حرارتی در طول فرآیند تقویت PCR استفاده شود. با اندازه‌گیری فلورسانس منتشر شده توسط RoX، محققان می‌توانند سازگاری مراحل گرمایش و سرمایش در ترموسایکلر را ارزیابی کنند، که برای به دست آوردن نتایج PCR ریل تایم قابل اطمینان و قابل تکرار بسیار مهم است.

مفهوم ROX و نقش آن در qPCR

ROX یک رنگ فلورسانس پسیو است که به واکنش‌های qPCR اضافه می‌شود تا نوسانات در شدت فلورسانس را که ممکن است به دلیل تغییرات در مقدار نمونه یا شرایط واکنش باشد، جبران کند. این رنگ به طور مستمر فلورسانس را منتشر می‌کند، و این انتشار فلورسانس به عنوان یک نقطه مرجع برای مقایسه با فلورسانس تولید شده توسط پروب‌های فعال در واکنش استفاده می‌شود.

کاربردهای ROX در qPCR

1. کنترل کیفیت

یکی از اصلی‌ترین کاربردهای ROX در qPCR، کنترل کیفیت است. با استفاده از ROX، می‌توان تغییرات در شدت سیگنال فلورسانس را که ممکن است به دلیل خطاهای پیپت کردن، تغییرات دما یا تغییرات دستگاه باشد، تصحیح کرد. ROX به عنوان یک کنترل داخلی عمل می‌کند و تضمین می‌کند که هر گونه تغییر در سیگنال فلورسانس به دلیل تغییرات واقعی در نمونه‌ها است و نه به دلیل مشکلات فنی.

2. نرمال‌سازی داده‌ها

نرمال‌سازی داده‌ها یکی دیگر از کاربردهای مهم ROX در qPCR است. نرمال‌سازی با استفاده از ROX به این صورت انجام می‌شود که فلورسانس تولید شده توسط ROX به عنوان یک مرجع برای تنظیم فلورسانس تولید شده توسط پروب‌های فلورسانس دیگر در واکنش استفاده می‌شود. این فرآیند به کاهش خطاهای ناشی از تغییرات در شرایط واکنش کمک می‌کند و دقت نتایج را افزایش می‌دهد.

3. بهبود دقت و قابلیت تکرارپذیری

استفاده از ROX می‌تواند دقت و قابلیت تکرارپذیری نتایج qPCR را بهبود بخشد. با نرمال‌سازی فلورسانس تولید شده توسط پروب‌ها به نسبت فلورسانس ROX، می‌توان تضمین کرد که نتایج به دست آمده از qPCR دقیق‌تر و قابل تکرارتر هستند. این امر به ویژه در تحقیقات پزشکی و بالینی که دقت بالایی مورد نیاز است، بسیار مهم است.

4. کاهش اثرات نویز

نویز در داده‌های qPCR می‌تواند به دلایل مختلفی از جمله تغییرات در شدت نور لیزر، اختلاف در تنظیمات دستگاه و تغییرات در ترکیب شیمیایی واکنش‌ها ایجاد شود. ROX به کاهش این نویزها کمک می‌کند و باعث می‌شود که نتایج به دست آمده از qPCR دقیق‌تر و قابل اعتمادتر باشند.

مکانیسم عملکرد ROX

ROX به عنوان یک رنگ پسیو به واکنش qPCR اضافه می‌شود و به طور مستمر فلورسانس منتشر می‌کند. این فلورسانس ثابت به عنوان یک مرجع برای تنظیم فلورسانس تولید شده توسط پروب‌های فعال در واکنش استفاده می‌شود. هنگامی که دستگاه qPCR سیگنال‌های فلورسانس را اندازه‌گیری می‌کند، از فلورسانس ROX به عنوان یک استاندارد داخلی برای تصحیح هر گونه تغییرات در شدت فلورسانس استفاده می‌کند. این فرآیند تضمین می‌کند که هر گونه تغییر در سیگنال‌های فلورسانس به دلیل تغییرات واقعی در نمونه‌ها است و نه به دلیل مشکلات فنی یا نویز.

تفاوت بین ROX و سایر رنگ‌های فلورسانس

در حالی که ROX به عنوان یک رنگ پسیو در qPCR استفاده می‌شود، رنگ‌های فلورسانس دیگری نیز وجود دارند که به عنوان پروب‌های فعال عمل می‌کنند. این پروب‌ها برای تشخیص و کمی‌سازی توالی‌های خاص DNA و RNA طراحی شده‌اند و فلورسانس را تنها زمانی منتشر می‌کنند که با توالی هدف پیوند بخورند. در مقابل، ROX به طور مستمر فلورسانس منتشر می‌کند و به عنوان یک مرجع ثابت عمل می‌کند.

مزایای استفاده از ROX

1. بهبود دقت نتایج: استفاده از ROX به نرمال‌سازی سیگنال‌های فلورسانس کمک می‌کند و باعث می‌شود که نتایج qPCR دقیق‌تر باشند.
2. کاهش نویز و خطاهای فنی: ROX به کاهش نویزهای ناشی از تغییرات در شرایط واکنش و تنظیمات دستگاه کمک می‌کند.
3. افزایش قابلیت تکرارپذیری: با استفاده از ROX، می‌توان نتایج qPCR را با دقت بیشتری تکرار کرد.
4. کنترل کیفیت: ROX به عنوان یک کنترل داخلی عمل می‌کند و تضمین می‌کند که هر گونه تغییر در سیگنال فلورسانس به دلیل تغییرات واقعی در نمونه‌ها است.

محدودیت‌های استفاده از ROX

با وجود مزایای متعدد، استفاده از ROX نیز دارای محدودیت‌هایی است. برای مثال، همه دستگاه‌های qPCR از ROX به عنوان یک مرجع پسیو پشتیبانی نمی‌کنند. علاوه بر این، استفاده از ROX ممکن است باعث افزایش هزینه‌های واکنش qPCR شود.

نرمالیزه کردن و عیب یابی واکنش‌های qPCR

طی فرآیند PCR، سطح فلورسانس ROX، که یک رنگ مرجع غیرفعال فلورسنت است ثابت باقی می‌ماند. وقتی داده‌های qPCR با استفاده از ROX نرمال شوند، تاثیر اختلافات چاهک به چاهک مانند تغییرات مقدار تراکم، تابش ناهمسان و تغییرات جزئی در اپتیک  کاهش می‌یابد. در اکثر ابزارهای PCR بلادرنگ برای نرمال سازی این منبع و سایر منابع اختلاف ایجاد کننده در نتایج، از ROX استفاده می‌شود. از آنجا که ROX بر فرآیند PCR یا طیف انتشار سایر رنگ‌های خاموش کننده و گزارشگر TaqMan تأثیر نمی‌گذارد، رنگ مرجع غیرفعال ترجیحی محسوب‌می‌شود.

ویژگی‌ها

ویژگی‌های رنگ مرجع غیرفعال ROX عبارتند از: نرمال سازی نوسانات فلورسانس غیرمرتبط با PCR- با نرمال کردن داده‌ها توسط یک مرجع غیرفعال مانند رنگ ROX، تکرارها را می‌توان با دقت بیشتری تراز کرد. اگر نرمال سازی انجام نشود، برای رسیدن به همان سطوح دقت، تکرارهای بیشتر و در واقع زمان و منابع بیشتری برای هر اجرا نیاز است. هنگام استفاده از داده‌هایی که با رنگ ROX نرمال شده‌اند، محققان می‌توانند با حفظ قدرت آماری از تکرارهای کمتری استفاده‌کنند زیرا این داده‌ها بسیار دقیق‌تر از داده غیرنرمالیزه است.

تهیه یک خط پایه پایدار برای PCR کمّی چندگانه و RT-PCR

بیشتر بخوانید:لدر چیست؟

در یک نمودار یا پلات چند جزئی، سیگنال ROX باید در طول فرآیند qPCR ثابت بماند. هر گونه رویداد غیرمرتبط با PCR منجر به اسپایک، افت یا سایر رفتارهای غیرعادی در سیگنال‌های ROX و گزارشگر می‌شود.

استفاده از رنگ ROX برای عیب یابی مشکلات رایج در qPCR

برای نرمال‌سازی در برابر متغیرهای متعددی که باعث تغییرات چاهک به چاهک می‌شوند می‌توان از رنگ‌های مرجع غیرفعال استفاده‌کرد. بر خلاف رنگ‌های مرتبط با پروب که امکان شناسایی یک یا چند هدف را در یک چاهک فراهم می‌کنند، این رنگ تحت‌تأثیر فرآیند PCR قرار نمی‌گیرد.

منابع رایج خطاهای فرآیند که می‌توانند داده‌های شما را به خطر بیندازند:

-وجود حباب در چاهک

-تبخیر

-متراکم شدگی یا قطرات

-مشکلات ابزاری مانند نوسانات الکتریکی

نظارت بر فلورسانس ROX در یک پلات چند جزئی، محققان را قادر می‌سازد تا مسائل مختلف کنترل کیفی را در اجرای qPCR شناسایی کنند. برای عیب یابی داده‌ها با استفاده از پلات چند جزئی، شکل سیگنال رنگ ROX را بررسی کنید:

اگر خوانش رنگ راکس در طول اجرا مسطح ماند، نتیجه مورد انتظار: فلورسنس راکس باید در طول مدت واکنش ثابت بماند زیرا تحت تاثیر فرایند تکثیر قرار نمی گیرد. اگر در طول اجرا افزایش یافت، ممکن است تبخیر رخ داده باشد زیرا با کاهش حجم، غلظت راکس افزایش می یابد. اگر دچار اسپایک یا افت لحظه ای شد، تغییرات ناگهانی باعث اختلال در ضبط داده ها در آن چاهک می شود، مانند حباب های هوا یا نوسانات الکتریکی.

دستگاه‌های Real-time PCR که به رنگ ROX نیاز دارند:

1. Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
2. Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System
3. Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR Systems
4. Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR Systems
5. Applied Biosystems QuantStudio 3 Real-Time PCR Systems
6. Applied Biosystems QuantStudio 5 Real-Time PCR Systems، که سیستم های های QuantStudio بر اساس مدل، می تواند با رنگ راکس استفاده شود ولی در تمام تست ها اجباری نیست و معمولا به غلظت کمی از راکس برای واکنش های خود  نیاز دارند.

دستگاه‌های Real-time PCR که به رنگ ROX نیاز ندارند:

1. Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System
2. Roche LightCycler 480 Real-Time PCR System
3. Qiagen Rotor-Gene Q Real-Time PCR Cycler
4. Eppendorf Mastercycler RealPlex
5. Agilent AriaMx Real-Time PCR System

مقاله به بررسی استفاده از رنگ مرجع پسیو ROX در تکنیک qPCR پرداخته است. تکنیک qPCR یکی از حساس‌ترین و دقیق‌ترین روش‌ها برای تحلیل ژن است که نیاز به مانیتورینگ سیگنال فلورسانس دارد تا پیشرفت واکنش تقویت را در هر چرخه گزارش دهد. عواملی مانند خطاهای پیپت کردن، تبخیر، تراکم یا قطرات می‌توانند باعث ایجاد نوسانات در سیگنال فلورسانس و داده‌های غیرقابل اعتماد شوند. به منظور جبران این نوسانات، استفاده از رنگ مرجع پسیو ROX توصیه می‌شود.

لینک دانلود مقاله

کلام آخر

به طور خلاصه، RoX یک ابزار ارزشمند در ریل تایم PCR برای عادی سازی سیگنال های فلورسانس، تشخیص تغییرات در شرایط واکنش، و نظارت بر عملکرد سیکلر حرارتی است. استفاده از آن به اطمینان از دقت و قابلیت اطمینان آزمایش‌های PCR ریل تایم کمک می‌کند و آن را به یک جزء ضروری در تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی تبدیل می‌کند. جهت دریافت مشاوره و خرید انواع دستگاه ها و محصولات مولکولی با کارشناسان ما در ماناتک تماس حاصل فرمایید.

Rotor Gene

بازه قیمت 900 الی ۱ میلیارد و ۱۰۰

دستگاه ریل تایم پی سی آر مدل CFX از برند آمریکایی Bio-Rad در دو مدل 6 کاناله (یک کانال برای Fast PCR) و 5 کاناله با 96 و 384 چاهک به بازار عرضه گردیده است. سیستم شناسایی این دستگاه شامل سیستم نوری پیشرفته به همراه…

خرید دستگاه

Step One

بازه قیمت ۶۰۰ الی۹۰۰ میلیون

سیستم ریل تایم Step One یک ابزار کاربرپسند، مناسب برای طیف وسیعی از کاربردهای تحقیقاتی و تشخیصی در زیست‌شناسی مولکولی است. طراحی آن بر سهولت استفاده، دقت و کارآمدی تمرکز دارد.

خرید دستگاه

CFX 96

بازه قیمت ۸۰۰ الی ۱ میلیارد

دستگاه ریل تایم پی سی آر مدل CFX از برند آمریکایی Bio-Rad در دو مدل 6 کاناله (یک کانال برای Fast PCR) و 5 کاناله با 96 و 384 چاهک به بازار عرضه گردیده است. سیستم شناسایی این دستگاه شامل سیستم نوری پیشرفته به همراه…

خرید دستگاه