طراحی پرایمر 1

طراحی پرایمر در PCR

PCR یک تکنیک بیولوژی مولکولی است که برای تکثیر یا تقویت DNA الگو به کار میرود. پرایمرها مولکول های کوتاه تک رشته ای از DNA هستند که به ناحیه هدف در DNA الگو متصل میشوند و شروع کننده سنتز رشته جدید DNA توسط آنزیم پلیمراز هستند. بنابراین، پرایمرها باید به گونه ای طراحی شوند که فقط به ناحیه هدف در DNA الگو بچسبند و هیچ جای دیگر. طراحی پرایمر در PCR به این معنی است که توالی و خصوصیات پرایمرها را به گونه ای انتخاب کنیم که باعث افزایش کارایی، دقت و ویژگی PCR شوند.

برخی از عوامل مهم در طراحی پرایمر عبارتند از:

• طول پرایمر: طول مناسب پرایمر بین 18 تا 22 باز است. اگر پرایمر خیلی کوتاه باشد، احتمال اتصال غیراختصاصی به DNA الگو بالا می رود. اگر پرایمر خیلی بلند باشد، احتمال تشکیل ساختارهای دو رشته ای خود با خود (self-dimer) یا با پرایمر دیگر (cross-dimer) بالا میشود.
• دمای ذوب پرایمر: دمای ذوب پرایمر دمایی است که در آن نصف پرایمرها تک رشته ای و نصف دیگر دو رشته ای هستند. این دما به شدت به محتوای GC (گوانین و سیتوزین) پرایمر بستگی دارد. به طور کلی، دمای ذوب پرایمر بین 52 تا 58 درجه سانتی گراد مناسب است. همچنین، دمای ذوب دو پرایمر باید حداکثر 3 درجه اختلاف داشته باشند.
• محتوای CG: محتوای GC به نسبت بازهای GC در توالی پرایمر اشاره دارد. به طور کلی، محتوای GC بین 40 تا 60 درصد مناسب است. اگر محتوای GC خیلی کم باشد، پرایمر به خوبی به DNA الگو نچسبیده و جدا میشود. اگر محتوای GC خیلی زیاد باشد، پرایمر به شدت به DNA الگو چسبیده و جابجا نمیشود.
• GC Clamp: GC Clamp به این معناست که حداقل ۲ تا ۴ باز GC در انتهای ۳’ پرایمر قرار داده شود. این کار باعث میشود که پرایمر به قسمت حساس و مهم ناحیه هدف بهتر بچسبد و احتمال جدا شدن پرایمر در دمای بالا را کاهش دهد.
• دمای Tm: دمای Tm به معنای دمای ذوب پرایمر است که نشان میدهد پرایمر در چه دمایی از DNA الگو جدا میشود. این دما بستگی به طول و محتوای GC پرایمر دارد. معمولاً دمای Tm پرایمر بین ۵۵ تا ۶۵ درجه سانتیگراد باشد. اگر دمای Tm پرایمر خیلی بالا باشد، ممکن است پرایمر در دمای انیلینگ (که معمولاً بین ۵۰ تا ۶۰ درجه سانتیگراد است) به DNA الگو نچسبد و کارایی را کاهش دهد. اگر دمای Tm پرایمر خیلی کم باشد، ممکن است پرایمر در دمای انلینگ به نواحی دیگر از DNA الگو بچسبد و اختصاصیت را کاهش دهد.
• طول قطعه تکثیری: طول قطعه تکثیری بستگی به هدف و نوع PCR دارد. معمولاً برای PCR معمولی، طول قطعه تکثیری بین ۱۰۰ تا ۳۰۰۰ باز باشد. برای PCR طولانی، طول قطعه تکثیری میتواند بین ۳۰۰۰ تا ۴۰۰۰۰ باز باشد. برای PCR کوتاه، طول قطعه تکثیری میتواند کمتر از ۱۰۰ باز باشد.
• ساختار دو رشته ای: ساختار دو رشته ای به تشکیل پل هیدروژن بین بازهای 5′ و 3′ در یک پرایمر (self-dimer) یا بین دو پرایمر (cross-dimer) اشاره دارد. این ساختار باعث کاهش کارکرد و تولید محصولات غیراختصاصی میشود. بنابراین، باید از توالی هایی که احتمال تشکیل ساختار دو رشته ای دارند، خودداری کرد.

علاوه بر این نکات، عوامل دیگری نظیر ساختار secondary، self-complementarity و cross-complementarity نیز در طراحی پرایمر تاثیرگذار هستند. این عوامل باعث می شوند که پرایمرها self-dimer،  primer-dimer شوند یا به ناحیه های غیر مورد نظر از تمپلیت بچسبد و باعث تولید محصولات غیر اختصاصی یا کم کارایی شود. بنابراین، باید از انتخاب پرایمرهایی که دارای این خصوصیات هستند خودداری کرد.

 (Basic Local Alignment Search Tool) NCBI

یک ابزار قدرتمند برای مقایسه توالی‌های نوکلئوتیدی یا پروتئینی با پایگاه‌های داده است. در زمینه طراحی پرایمر، BLAST می‌تواند به شما کمک کند تا اطمینان حاصل کنید که پرایمر‌های شما به مناطق مورد نظر و تنها به آن مناطق متصل می‌شوند و اتصالات نادرست یا ناخواسته ندارند.

برای طراحی پرایمر در مرحله اول باید توالی ژن مورد بررسی را با فرمت FASTA  از بانک های توالی اسید نوکلئیکی از جمله سایت NCBI  بدست آورد. یکی از معروف ترین و معتبرترین بانک های توالی، NCBI است که شامل بخش های مختلفی مثل GenBank، RefSeq، dbSNP و … است. شما می توانید با استفاده از نام علمی گونه، نام ژن، شماره accession یا هر شناسه دیگری به جستجوی توالی خود بپردازید.

بیشتر بخوانید:دستگاه دیجیتال pcr

در زیر مراحل استفاده از BLAST برای بررسی پرایمر‌ها آورده شده است:

1. مراجعه به وب‌سایت BLAST: به وب‌سایت NCBI BLAST بروید.
2. انتخاب پایگاه داده: در بخش “Choose Search Set”، پایگاه داده‌ای را که می‌خواهید جستجو کنید انتخاب کنید. معمولاً “nucleotide collection (nr/nt)” انتخاب می‌شود.
3. وارد کردن توالی پرایمر: در بخش “Enter Query Sequence”، توالی پرایمر خود را وارد کنید.
4. اجرای جستجو: بر روی دکمه “BLAST” کلیک کنید.
5. تحلیل نتایج: پس از اجرای جستجو، نتایج به شما نمایش داده می‌شود. به دنبال هر گونه تطابق با دقت بالا در پایگاه داده بگردید. اگر تطابق‌های ناخواسته یا نادرست وجود داشته باشد، ممکن است بخواهید پرایمر خود را مجدداً طراحی کنید.
6. بررسی پرایمر دوم: همین فرآیند را برای پرایمر دوم (یا پرایمر عقبی) تکرار کنید.

استفاده از BLAST برای بررسی پرایمر‌ها به شما اطمینان می‌دهد که پرایمر‌های شما به مناطق مورد نظر در ژنوم متصل می‌شوند و احتمال اتصالات نادرست کاهش می‌ یابد.

نرم افزارهای طراحی پرایمر

نرم افزارهای طراحی پرایمر ابزارهای کامپیوتری هستند که با استفاده از الگوریتم های مختلف، پرایمرهای بهینه را بر اساس معیارهای مختلف مانند دمای ذوب، گاما، هم ترازی، وضعیت GC و طول پرایمر پیشنهاد میدهند. این نرم افزارها در دو نوع مختلف استفاده میشوند. نوع اول تحت وب هستند و به صورت آنلاین می توان برای طراحی پرایمر از آنها استفاده کرد. نوع دوم تحت سیستم عامل هستند و باید روی کامپیوتر نصب شوند.

برخی از نرم افزارهای تحت وب طراحی پرایمر عبارتند از:

• Primer3: یک نرم افزار رایگان و قابل دسترس است که بر اساس الگوریتم Primer3Core، پرایمرها را طراحی میکند. این نرم افزار قابلیت تعیین ژنوم مورد نظر را دارد و محدود به چند ژنوم خاص نیست.
• Primer3Plus: یک نسخه بهبود یافته از Primer3 است که رابط کاربری ساده تر و قابلیت های بیشتری دارد. این نرم افزار همچنین قابلیت تعیین ژنوم مورد نظیر را دارد و محدود به چند ژنوم خاص نیست.
•  Primer-BLAST: یک ابزار آنلاین است که توسط موسسه ملی بهداشت آمریکا (NCBI) ارائه شده است. این ابزار قادر است پرایمرهای مناسب را با توجه به شروط PCR و داده های ژنوم NCBI پیدا کند. همچنین، این ابزار قادر است پرایمرهای طراحی شده را با داده های NCBI مقایسه کند و در صورت وجود همخوانی با DNA های غیر هدف، آن ها را نشان دهد.

• PCR Primer Design: یک نسخه تلفيق شده از Primer3 و OligoCalc است كه علاوه بــــــــــــــر طراحی پرایمر، قابلیت محاسبه خصوصیات فیزیکی و شیمیایی پرایمرها را دارد. این نسخه به شما کمک میکند تا پرایمرهای با کیفیت بالا برای PCR خود انتخاب کنید.
• PrimerQuest: یک نسخه تلفيق شده از Primer3 و PrimerQuest Tool است كه علاوه بــــــــــــــر طراحی پرایمر، قابلیت طراحی آله های مولکولی مانند qPCR، SNP Genotyping و NGS Library Preparation را دارد. این نسخه به شما کمک میکند تا پرایمرها و آلل های مناسب برای کاربردهای مختلف را طراحی کنید.

کلام آخر

در این مقاله سعی کردیم تا ویژگی های مهم در طراحی پرایمر و نرم افزارهای تحت وب را برای شما معرفی کنیم. برای دریافت اطلاعات کامل تر، مقاله طراحی پرایمر 2 را مطالعه فرمایید. برای خرید انواع دستگاه ترموسایکلر PCR و اطلاع از سایر محصولات و خدمات شرکت ماناتک، با مشاوران ما تماس حاصل فرمائید.