الکتروفورز افقی

الکترو فورز افقی یک روش قدیمی و کاربردی است که در آن مولکول‌ های سلولی مانند DNA ، RNA با بار منفی و پروتئین را با استفاده از جریان الکتریکی روی یک ژل آگارز جدا می‌ کند. در pcr، الکترو فورز افقی می‌ تواند برای تعیین اندازه و خلوص محصولات تولید شده توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مورد استفاده قرار گیرد.

انواع الکتروفورز:

• الکتروفورز عمودی:

یک روش جداسازی پروتئین ها بر اساس اندازه و بار آنها است. در این روش، پروتئین ها را در یک محلول حاوی دترجنت قرار میدهند تا به صورت خطوط خالص شوند. سپس این پروتئین ها را در ژل پلی آکریل آمید PAGE)) که به صورت یک استوانه عمود بر جریان الکترون قرار دارد، قرار میدهند. با عبور جریان الکترون، پروتئین ها با توجه به قطبیدگی خود به سمت الکترود مثبت حرکت میکنند. پروتئینهای کوچکتر سرعت بالاتر و فاصله بالاتر را طی میکنند. در نهایت، پروتئین ها را با استفاده از روشهای رنگ آمیزی ژل مشاهده میکنند. الکتروفورز عمودی کاربردهای مختلفی دارد، مانند تجزیه و تحلیل پروفایل پروتئین، تعیین خلوص و کمی DNA و RNA و بررسی تغییرات ژنتیکی.

وسایل و مواد موردنیاز برای انجام الکتروفورز افقی :

• پودر آگارز
• بافر TBE 1X
• Loading Buffer
• Ladder Marker
• سینی ژل
• شانه ژل
• تانک الکتروفورز
• منبع تغذیه الکتریکی یا پاور ساپلای
• سمپلر و سر سمپلر

برای انجام الکتروفورز افقی، شما نیاز به چند مرحله دارید:
• آماده سازی ژل آگارز و ریختن آن در قالب الکتروفورز
• حل کردن نمونه‌های DNA یا RNA در بافر مناسب
• بارگذاری یا ران نمونه‌ها و کنترل ها در چاه‌های ژل
• اعمال ولتاژ مناسب برای جداسازی مولکول‌ها بر اساس اندازه
• رنگ آمیزی ژل با استفاده از مواد رنگزای DNA
• مشاهده و تفسیر نتایج

لدر:

لدر در سایزهای متفاوت در بازار موجود می باشد ولی به طور معمول بسته به سایز محصول یا DNA شما انتخاب می شود. برای مثال طول قطعات 100-1000 را از لدر 100bp و قطعات با طول بیشتر از 1000bp یا 1kb را از لدر 1kb استفاده می کنیم.
به این صورت که لدر 100، فاصله بین باندهای ایجاد شده بر روی ژل 100 می باشد یعنی خط یا باند اول لدر که دیده می شود سایز 100 و دومی عدد 200 را نشان می دهد و برای درک بهتر: نمونه ای که به موازات خط دوم لدر باند نمایان شده یعنی طول 200 را نشان می دهد و طبق پروتکل طراحی پرایمر و عدد درج شده در بروشور شما میتوانید صحت باند حاصل شده را متوجه شوید.
نکته بعدی این است که نمونه ها با سایز بزرگ تر، سنگین تر بوده و به همین خاطر آهسته تر به سمت قطب مثبت حرکت می کنند و بالعکس و این گونه نمونه با سایز های مختلف از هم فاصله می گیرند.

نحوه درست کردن بافر TBE: 

از تریس Tris، بوریک اسید boric acid و EDTA ساخته می شود. تریس و بوریک اسید جامد هستند، این دو را ترکیب کرده و سپسEDTA را اضافه کرده (محتوا با حجم 100) و با افزودن آب مقطر، محلول را به حجم 1 لیتر می رسانیم و روی شعله می گذاریم و زمانی که محلول شفاف شود آماده می باشد. استریل کردن TBE فراموش نشود و میتوان این محلول را با درب بسته در دمای محیط نگهداری کرد.

نحوه انجام الکتروفورز:

برای انجام الکتروفورز محصولات PCR از ژل آگارز با غلظت 1% تا 2% (0.4 و 0.8 گرم در 40 میلی لیتر بافر X TBE 0.5 ) یا به میزان 1.3 گرم پودر آگارز در 130 میلی لیتر بافر TBE(غلظت 1% ) بسته به سایز تانک شما که کوچک است یا بزرگ، حل کرده و بعد از حرارت دادن و قبل از خنک شدن به میزان 4-3 میکرولیتر ژل رد برای رنگ آمیزی به آن اضافه میکنیم. محلول را داخل کاست در تانک ریخته و به کمک شانه، چاهک ها برای لود نمونه آماده می شود. پس از بسته شدن ژل، آن را از کاست خارج کرده و به داخل تانک الکتروفورز انتقال میدهیم.

مقدار 3-5 میکرولیتر از محصول PCR را با 1 میکرولیتر Loading Buffer 6 X مخلوط کرده و داخل چاهک های ژل برای الکتروفورز قرار میدهیم. پس از ریختن تمام نمونه ها و لود در چاهک، جریان الکتروفورز را برقرار کرده (ولتاژ مناسب 100) و DNA حرکت کرده و از سمت با بار منفی به سمت بار مثبت حرکت میکند (از کاتد به آند) و لدر نیز باز می شود. در نهایت با گذشت 30-40 دقیقه وقتی نمونه ها سه چهارم طول ژل را طی کردند، جریان الکتروفورز را خاموش کرده و تصویر ژل را به کمک دستگاه مجهز به منبع نور فرابنفش (ژلداک) مشاهده می کنیم.

نکات:

بافر TBE مناسب و یکسان برای پر کردن تانک برای برقراری جریان و همچنین برای تهیه ژل آگارز استفاده شود.
از بافر تازه و استفاده نشده برای تهیه ژل آگارز استفاده شود ولی میتوان از بافر استفاده شده برای پر کردن تانک استفاده شود.
درصد ژل آگارز را متناسب با سایز نمونه ها انتخاب کنید. برای محصولات PCR با سایزهای بزرگتر از 100 ژل آگارز 1 درصد تهیه کنید.

برخی از راههای بهبود کارایی الکتروفورز افقی عبارتند از:
• انتخاب ژل مناسب: برای جداسازی مولکولهای باردار با اندازه های مختلف، باید ژل با نوع و درصد مناسب را انتخاب کرد. ژلهای مختلفی مانند آگاروز، پلی آکریل آمید، سلولز استات و پلی آکریلات وجود دارند که هر کدام خصوصیات و کاربردهای خاص خود را دارند. برای مثال، ژل آگاروز مناسب برای جداسازی DNA با اندازه بالاتر از ۵۰۰ پیریمیدین است و ژل پلی آکریل آمید مناسب برای جداسازی پروتئینها و DNA با اندازه پایینتر از ۵۰۰ پیریمیدین است.

بیشتر بخوانید:دستگاه دیجیتال pcr

• تنظیم شرایط الکتروفورز: برای جلوگیری از گرم شدن بیش از حد ژل و تغییر شکل آن، باید شرایط الکتروفورز را به صورت مناسب تنظیم کرد. مقادیر مناسب و کافی از محلولهای بافر، دترژان و نمک را به محلول مولکولهای باردار و ژل اضافه کرده و دما و ولتاژ مناسب را برای الکتروفورز رعایت کنید. همچنین باید محافظت کافی را از نور UV در هنگام الکتروفورز انجام دهید تا از تخریب DNA جلوگیری کنید.

• استفاده از روشهای رنگ آمیزی حساس: برای مشاهده مولکولهای باردار در ژل، باید از روشهای رنگ آمیزی حساس استفاده کرد. روشهای رنگ آمیزی حساس میتوانند مولکولهای با غلظت پایین را نشان دهند و تفاوت بین مولکولها را به خوبی نشان دهند.

خطایابی و رفع خطا Troubleshooting:

برای حصول اطمینان از درست کار کردن الکتروفورز، میتوانید لدر به میزان 3-4 لاندا بر روی ژل ران کرده و 10-5 دقیقه صبر کنید تا ببینید روی ژل باند(اولین و نزدیک ترین باند، 100 است) نمایان می شود یا خیر که اگر باند دیده نشد یعنی الکترو فورز در جریان نبوده است مثلا ممکن است قطب منفی و مثبت را معکوس وصل کرده باشید (سیم های مشکی و قرمز) یا لدر را داخل چاهک به درستی ران نکرده اید و به بیرون ژل ریخته اید.

در صورت عدم مشاهده باند، ممکن است پرایمر به نقاط مورد نظر در قسمت الگو متصل نشده باشد یا پرایمر اختصاصی نباشد یا غظت پرایمر کم باشد یا ستاپ نادرست هر یک از اجزای محصول pcr از جمله DNA یا تمپلیت وجود داشته باشد یا پروتکل دمایی داده شده به دستگاه ترموسایکلر دچار اشکال باشد و شما ملزم به اشکال یابی و تکرار مراحل می باشید .

همچنین برای مثال اگر عدد 200، طول قطعه PCR شما می باشد، با مشاهده باند 300 به هدف خود نرسیده اید و باندی غیر اختصاصی بدست آورده اید و لذا باید خطای کارتان را تفسیر کرده، خطا را رفع کرده و مجدد فرایند الکترو فورز تان را تکرار کنید.

کلام آخر

در این مقاله به الکترو فورز افقی اشاره شد، هم چنین ما سعی کردیم نکاتی را به شما بگوییم تا شما بیشتر با الکترو فورز افقی آشنا بشوید.

.