سبد خرید شما

برای شما

پشتیبانی

تماس با پشتیبانی

شبکه های مجازی

  • اینستاگرام
  • تلگرام
  • ایتا
دستگاه ریل تایم PCR

دستگاه ریل تایم PCR

تفاوت دو تکنیک PCR و ریل تایم PCR

تفاوت دستگاه ریل تایم PCR  در این است که PCR یک روش کیفی برای تشخیص وجود یا عدم وجود DNA یا RNA هدف در نمونه است، اما ریل تایم PCR یک روش کمی برای اندازه گیری مقدار DNA یا RNA هدف در نمونه است.

در PCR، محصولات تکثیر شده در انتهای واکنش با استفاده از ژل الکتروفورز جداسازی و رنگ آمیزی میشوند. در  روش ریل تایم، از یک مولکول گزارشگر فلورسنت برای مشاهده پیشرفت PCR استفاده میشود و قدرت سیگنال فلورسانس تولید شده ارتباط مستقیمی با مقدار مولکول های تکثیر شده دارد. بنابراین، ریل تایم PCR دقت، حساسیت، سرعت و خودکار بودن بالاتری نسبت به PCR دارد.

تفاوت دو تکنیک PCR و ریل تایم PCR

تفاوت دو تکنیک PCR و ریل تایم PCR

تکنیک Real-time PCR یا PCR کمی (qPCR)

Real-time PCR ، qPCR هم نامیده میشود، این واژه از  quantitative  به معنای کمی گرفته شده است. طبق قرارداد ها اگر قرار است در مقالات از ریل تایم نام ببریم، بهتر است  از qPCR  استفاده شود.

یکی از مزایای این تکنیک، قابلیت مانیتورینگ لحظه به لحظه واکنش است و به همین سبب، نام ریل تایم یا زمان واقعی به این تکنیک داده شده است.  این امر باعث بهینه‌سازی واکنش و تعیین مناسب‌ترین غلظت DNA  و پرایمر و همچنین تعداد سیکل لازم برای تکثیر می‌شود. همچنین، این تکنیک برای بررسی بیان ژن‌ها، ارزیابی اثر داروی مورد نظر بر تغییرات بیان ژن، بررسی میزان بیان آنزیم‌های کبدی برای متابولیز کردن داروی خاص، ژن درمانی، شناسایی و تعیین Load عوامل عفونی، بررسی سرطان‌های خونی و تعیین ریسک بازگشت آن و تعیین میزان موفقیت پیوند اعضاء به کار می‌رود.

تکنیکی که علاوه بر بررسی وجود یا عدم وجود یک پاتوژن، به ما میگوید که چه میزان copy number  از پاتوژن در نمونه های مختلف وجود دارد.

تکنیک Real-time PCR یا PCR کمی (qPCR)

تکنیک Real-time PCR یا PCR کمی (qPCR)

برخی از کاربردهای این تکنیک عبارتند از:

  • تشخیص و شمارش ویروس ها، باکتری ها و قارچ ها در نمونه های بالینی
  • تعیین مقدار برداشت ژن gene expression در شرایط مختلف
  • تشخیص جهش ها، SNP ها و ژنهای بردار transgene در DNA
  • کلون سازی و نقشه برداری ژن ها
  • تعیین هویت افراد و پدیده های قانونی

مواد و دستگاه های مورد نیاز در تکنیک Real-time PCR

برای انجام تکنیک ریل تایم pcr نیاز به مواد و دستگاه های زیر دارید:

  • یک دستگاه ترمال سایکلر چند کاناله که قابلیت اندازه گیری فلورسنس را داشته باشد. این دستگاه با تغییرات دمایی متوالی، واکنش را پیش برده و سیگنال های نوری را ثبت می کند.
  • یک عدد لپ تاپ و (کابل برق) برای کار با نرم افزار دستگاه ریل تایم جهت کسب نتایج و گراف های این تکنیک
  • انواع سمپلر با سایزهای مختلف
  • یک مسترمیکس که شامل DNTP، بافر، نمک ها، آنزیم پلیمراز و در بیشتر مواقع هم رنگ فلوئوروفوری مانند سایبرگرین باشد. این مواد موجب تکثیر و رنگ آمیزی DNA در واکنش می شوند (نیاز به مستر میکس سایبرگرین)
  • پرایمر های فوروارد و ریورس که بر اساس توالی DNA هدف طراحی شده اند. این پرایمر ها با تعیین نقطه شروع و پایان سنتز رشته جدید، ناحیه مورد نظر را تکثیر می کنند.
  • پروب که یک توالی کوتاه DNA است که به ژن هدف متصل می شود. این پروب دارای یک رنگ گزارشگر و یک خاموش کننده است که با هیدرولیز شدن پروب، رنگ گزارشگر سیگنال فلورسنس را افزایش می دهد. این پروب برای تشخیص و کمی سازی ژن هدف به کار می رود (نیاز به مسترمیکس حاوی پروب)، البته بسته به روش کار ممکن است به پروب نیاز نداشته باشیم و فقط از فلورسنت سایبرگرین استفاده نماییم.

(که میتوانید برای خرید انواع مسترمیکس های PCR و ریل تایم PCR سایبرگرین و پروب (با میزان راکس بالا، کم و بدون راکس) و دریافت مشاوره جهت تهیه بهترین مسترمیکس مطابق با دستگاه و متد شما، مقالات ما  با عنوان های مسترمیکس را مطالعه کرده و با ما تماس حاصل فرمایید.)

  • آب دیونیزه برای حل کردن مواد و تعدیل حجم واکنش
  • اقلام پلاستیکی مصرفی استریل از جمله انواع میکروتیوب و ستون، سر سمپلر های DNase RNase free  و …

که میتوانید برای خرید انواع اقلام مصرفی پلاستیکی مورد نیاز خود، با مدیر فروش مجموعه ماناتک تماس حاصل فرمایید.

منحنی تکثیر در Real-time PCR

در Real-time PCR، منحنی میزان تکثیر محصول در هر سیکل PCR ترسیم می‌شود و این منحنی شامل سه فاز می‌باشد که همانطور که در تصویر زیر مشاهده به ترتیب شامل فاز Baseline region یا Linear phase ، فازهای Exponential و plateau phase است.

در فازBaseline region، میزان تکثیر محصولات به قدری نیست که سبب افزایش نور فلورسنت گردد. در فازExponential phase، میزان محصول دو رشته‌ای در هر چرخه دو برابر می‌شود بنابراین میزان محصولات به صورت نمایی افزایش می‌یابد. در فازPlateau phase، ترکیبات واکنش از بین می‌روند و دیگر محصولی تکثیر نمی‌شود بنابراین افزایشی در میزان فلورسنت مشاهده نمی‌شود.

منحنی تکثیر در Real-time PCR

منحنی تکثیر در Real-time PCR

اصطلاح CT

Ct مخفف cycle threshold است و نشان دهنده تعداد چرخه های PCR است که لازم است تا سطح فلورسانس گزارشگر به طور قابل تشخیصی بالاتر از پس زمینه شود. Ct معکوسا با مقدار اولیه DNA هدف در نمونه ارتباط دارد، به این معنی که هر چه مقدار DNA هدف بیشتر باشد، Ct کمتر خواهد بود.

کمی سازی اسید نوکلئیک را می توان به دو روش کلی انجام داد: کمی سازی مطلق و کمی سازی نسبی. کمی سازی مطلق به معنای تعیین تعداد دقیق کپی های DNA هدف در نمونه است، در حالی که کمی سازی نسبی به معنای تعیین نسبت بین تعداد کپی های DNA هدف و ژن گزارشگر یا ژن مرجع است.

برای کمی سازی مطلق، لازم است یک منحنی استاندارد را با استفاده از نمونه های با تعداد کپی شناخته شده از DNA هدف یا ژن مورد نظر ایجاد کنید. سپس با قرار دادن مقادیر Ct نمونه های ناشناخته روی منحنی استاندارد، مقادیر تعداد کپی را برای آنها پیدا کنید. برای این منظور، می توانید از پلاسمید، الگو، خط سلولی یا بافت استاندارد به عنوان منبع DNA هدف استفاده کنید.

تفسیر مفاهیم تکثیری در Real-time PCR

تعداد مولکول‌های DNA موجود در واکنش اولیه، تعیین کننده مقدار امپلیکون تولید شده پس از یک  چرخه PCR است. اگر در ابتدای فرآیند PCR تعداد کمی مولکول DNA وجود داشته باشد، مقدار کمی امپلیکون سنتز می‌شود. برعکس، اگر مقدار زیادی مولکول اولیه وجود داشته باشد، مقدار محصول بالاتر خواهد بود.

این رابطه امکان استفاده از PCR را برای محاسبه تعداد مولکول‌های DNA موجود در نمونه‌ها با اندازه‌گیری مقدار محصول تولید شده فراهم می‌کند. با این حال، با استفاده از PCR معمولی، که در آن امپلیکون‌ها پس از پایان فرآیندPCR)  تشخیص نقطه پایان) اندازه‌گیری می‌شوند، همبستگی کمّی بین تعداد مولکول‌های DNA اولیه و محصول PCR غیر دقیق می‌شود، زیرا تفاوت‌های بزرگ در تعداد DNA شروع کننده تفاوت‌های نسبتاً کم در محصولات PCR نهایی را ایجاد می‌کنند.

این به عواملی همچون حضور بازدارنده‌های واکنش پلیمراز، محدودیت واکنشگر و تجمع مولکول‌های پیروفسفات بستگی دارد. توانایی بررسی محصول PCR به صورت همزمان، به خصوص در فاز نمایی، PCR زمان واقعی را یک روش کمّی قابل اعتماد می‌کند. زیرا در این فاز، واکنش PCR، یک رابطه کمّی دقیق بین مقدار DNA شروع کننده و مقدار محصول PCR برقرار میکند. با تشخیص مقدار امپلیکون در فاز نمایی، امکان برگشت به عقب به مقدار DNA شروع کننده در ریکشن وجود دارد.

بیشتر بخوانید:آموزش تکنیک HRM برای شناساسی ژنوتیپ و جهش ها

تفسیر مفاهیم تکثیری در Real-time PCR

تفسیر مفاهیم تکثیری در Real-time PCR

مولکول های گزارشگر یا reporter

برای تکنیک Real-time PCR، مولکول های گزارشگری مختلفی می توانند استفاده شوند که بر اساس نوع اتصال به DNA هدف و نحوه تولید سیگنال فلورسنت دسته بندی می شوند. برخی از این مولکول ها عبارتند از:

رنگ های فلورسنت متصل شونده به DNA:

این رنگ ها به شکاف های کوچک DNA دو رشته ای متصل می شوند و با جذب نور با طول موج خاص، نور با طول موج دیگری را تابش می دهند. مثال از این رنگ ها سایبر گرین I و EvaGreen است.

پروب های فلورسنت هیدرولیز شونده:

این پروب ها الیگونوکلئوتیدهای کوتاهی هستند که دارای یک رنگ فلورسنت reporter در سر ۵’ و یک رنگ خاموش کننده quencher در سرِ ۳’ هستند. این پروب ها با پرایمر های PCR طوری طراحی می شوند که در حالت باز، رنگ خاموش کننده باعث کاهش سیگنال فلورسانس رنگ گزارشگر می شود. وقتی پروب به DNA هدف متصل شود، آنزیم Taq با فعالیت exonuclease خود پروب را بریده و رنگ گزارشگر را آزاد می کند. این باعث افزایش سیگنال فلورسانس می شود. مثال از این پروب ها TaqMan  و MGB Eclipse است.

پروب های فلورسنت غیر هیدرولیز شونده:

این پروب ها الیگونوکلئوتیدهای کوتاهی هستند که دارای چندین رنگ فلورسانس در توالی خود هستند. این پروب ها با پرایمر های PCR طوری طراحی می شوند که در حالت باز، رنگ های فلورسانس به صورت FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) با یکدیگر تعامل دارند و سطح سیگنال فلورسانس بسته به نحوه تعامل تغییر می کند. وقتی پروب به DNA هدف متصل شود، ساختار ثانویه پروب تغییر کرده و سطح سیگنال فلورسانس نشان دهنده حضور DNA هدف است. مثال از این گروه پروب ها Molecular Beacon و Scorpion است.

Molecular Beacon

ساختار یک Molecular Beacon به این شکل است که یک الیگونوکلئوتید تک رشته ای دارای یک رنگ فلورسنت  reporter در سرِ ۵’ و یک رنگ خاموش کننده quencher در سرِ ۳’ است.

این الیگونوکلئوتید به صورت حلقه مویینی hairpin درآمده و دو سر آن با هم تشکیل جفت های قاعده ای میدهند. بخش حلقه از الیگونوکلئوتید با توالی هدف متمایز است و میتواند با آن هیبرید شود. وقتی Molecular Beacon به توالی هدف متصل شود، ساختار حلقه مویینی باز شده و رنگ فلورسنت و رنگ خاموش کننده از هم دور میشوند. در نتیجه، سیگنال فلورسانس تولید میشود که نشان دهنده حضور توالی هدف است.

ژن های خانگی یا housekeeping gene

ژن های خانگی یا housekeeping gene در ریل تایم، ژن هایی هستند که تحت هر شرایطی بیان ثابتی دارند و برای استاندارد سازی بررسی بیان ژن های دیگر استفاده می شوند. این ژن ها معمولاً مربوط به فعالیت های حیاتی سلول هستند و نقش مهمی در نگهداری هومئوستاز سلول دارند. برخی از انواع ژن های خانگی عبارتند از:

  • ژن های کدکننده پروتئین های ساختاری سلول، مانند actin و tubulin
  • ژن های کدکننده آنزیم های مسیرهای متابولیک، مانند GAPDH و LDH
  • ژن های کدکننده عوامل رونویسی، مانند TBP و TFIIB
  • ژن های کدکننده ریبوزومال RNA، مانند S rRNA 18و S rRNA 28

 

ژن های خانگی یا housekeeping gene

ژن های خانگی یا housekeeping gene

کاربرد ژن های خانگی در ریل تایم

کاربرد ژن های خانگی در ریل تایم این است که با اندازه گیری مقدار بیان آنها در نمونه های مختلف، میتوان عامل نرمالایز کردن را به دست آورد و با آن مقدار بیان ژن هدف را تصحیح کرد. این کار باعث می شود تغییرات بیان ژن هدف تحت تاثیر خطاهای تجربی قرار نگیرد و تفاوت های واقعی در بین نمونه ها قابل مشاهده باشد.

کاربرد ژن های خانگی در ریل تایم

کاربرد ژن های خانگی در ریل تایم

RT-PCR  تکنیک

از نظر تئوری،Real-time PCR  تنها می تواند برای تقویت الگوها در قالب مولکول های DNA اعمال شود. پس چگونه می توان یک نمونه RNA را تشخیص داد و کمیت کرد؟

برای این منظور، ابتدا مولکولRNA  با استفاده از رونوشت معکوس به DNA مکمل (cDNA) رونویسی معکوس می شود و سپس cDNA تک رشته ای تولید شده به DNA دو رشته ای تبدیل می شود. سپس این DNA دو رشته ای با استفاده از PCR استاندارد تکثیر می شود. این روش به عنوان واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس  یا  RT-PCR شناخته می شود.

RT-PCR  تک و دو مرحله ای

RT-PCR  می تواند با استفاده از روش یک مرحله ای یا دو مرحله ای انجام شود. در RT-PCR یک مرحله ای، مرحله RT با PCR جفت می شود. در این فرآیند، RNA به cDNA معکوس رونویسی می شود و سپس در یک واکنش تکثیر می شود.

از مزایای اصلی این روش می‌توان به سرعت راه‌اندازی، ارزان‌بودن و دست‌کاری کمتر نمونه‌ها برای کاهش خطای پیپتینگ و آلودگی اشاره کرد. با این حال، از آنجایی که این روش از پرایمرهای اختصاصی ژن برای هر دو RT و PCR که در یک لوله واکنش رخ می‌دهند، استفاده می‌کند، دیگر ژن‌های مورد علاقه را نمی‌توان برای تجزیه و تحلیل بعدی تقویت کرد.

در RT-PCR دو مرحله ای، فرآیند از دو مرحله مجزا تشکیل شده است. مرحله اولیه یک واکنش RT برای ساخت cDNA است. مرحله دوم، تقویت cDNA با استفاده از PCR سنتی است. مزیت اصلی RT-PCR دو مرحله‌ای این است که cDNA معمولاً با استفاده از پرایمرهای تصادفی هگزامر یا الیگو-dT تولید می‌شود که امکان تبدیل کامل پیام‌های موجود در نمونه RNA به cDNA را فراهم می‌کند، از این رو، امکان تجزیه و تحلیل آینده ژن‌های دیگر را فراهم می‌کند.

کلام آخر

میتوانید برای خرید انواع مسترمیکس های PCR و ریل تایم PCR، اقلام مصرفی و دریافت مشاوره و خرید  بهترین دستگاه های  PCR و ریل تایم PCR، مقالات ما را مطالعه کرده و  با مشاوران ما در شرکت ماناتک تماس حاصل فرمایید.

5 1 رای
امتیازدهی به مقاله
اشتراک در
اطلاع از
guest
2 نظرات
قدیمی‌ترین
تازه‌ترین بیشترین رأی
بازخورد (Feedback) های اینلاین
مشاهده همه دیدگاه ها
شهاب اربابی
1 ماه قبل

برای انتخاب دستگاه شما مشاوره میدد؟
از کدوم دستگاه میشه بیشتر استفاده کرد که کمترین ارور رو داشته باشه و کار کردن باهاش راحت باشه؟

مهلا شهریاری
1 ماه قبل
پاسخ به  شهاب اربابی

سلامدوست عزیز . بله برای انتخاب دستگاه میتونید با مشاوران ما در تماس بشید تا بهترین انتخاب رو برای آزمایشگاه خودتون داشته اشید.