Digital PCR- پارت 01

تاریخچه پیدایش Digital PCR

سال 1992:

• معرفی: Digital PCR یا dPCR اولین بار توسط Sykes و Mullis معرفی شد. این تکنیک در ابتدا به عنوان “Limiting Dilution PCR” شناخته می‌شد. در dPCR، نمونه به تعداد کمی کپی‌های DNA یا RNA تقسیم می‌شود تا هر قسمت حاوی یک یا هیچ کپی از هدف باشد. این کپی‌ها در تعداد زیادی تکرار می‌شوند و سپس از توزیع Poisson برای تعیین تعداد کپی‌های اصلی استفاده می‌شود.

سال‌های 2000:

• توسعه‌ ی بیشتر: در دهه 2000، تکنولوژی dPCR از روش “Microfluidic Digital PCR” بهره‌برداری کرد که به تقسیم نمونه به صورت دقیق‌تر و کارآمدتر امکان می‌دهد.

سال‌های 2010:

• کاربرد بیشتر: در این دوره، dPCR به عنوان یک روش استاندارد در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی در زمینه بیولوژی مولکولی و ژنتیک پرکاربرد شد. شرکت‌های تجاری نیز دستگاه‌های dPCR تولید کردند که امکان انجام این روش را برای جوامع علمی فراهم کرد.

سال‌های 2015 و بعد:

• پیشرفت‌های فناوری: در سال‌های اخیر، فناوری dPCR به طور چشمگیری پیشرفت کرده است. دقت بالاتر، حساسیت بیشتر، و توانایی اندازه‌گیری هزاران اندک از خصوصیاتی هستند که این روش را در تحقیقات بیولوژی مولکولی بیشترین ارزش را می‌دهند. از آن زمان تا به امروز Digital PCR به عنوان یکی از روش‌های پیشرفته برای اندازه‌گیری دقیق میزان DNA و RNA در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و بالینی مورد استفاده قرار گرفته است و در تحقیقات مختلفی از جمله تشخیص بیماری‌ها، مطالعات ژنتیکی و بیولوژی مولکولی استفاده می شود.

Digital PCR چیست؟

Digital PCR یا dPCR یک روش توالی یابی اسید نوکلئیک است که با استفاده از تکنولوژی PCR و فلورسانس، می تواند مقدار مطلق (و نه نسبی) نوکلئیک اسیدهای موجود در نمونه را بدون نیاز به منحنی های استاندارد و رفرنس ها به دست آورد. این روش دارای دقت و حساسیت بالاتر از qPCR  است و می تواند توالی های کمیاب یا جهش یافته را در میان توالی های طبیعی شناسایی کند. این روش با تقسیم نمونه PCR به قطرات کوچک جداسازی شده، به حداقل رساندن رقابت بین توالی های هدف و با استفاده از آمار پواسون، تعداد مولکول های هدف را محاسبه می کند.

مراحل انجام Digital PCR به شرح زیر است:

1. تقسیم نمونه:

نمونه DNA یا RNA به پارت های کوچک‌تر تقسیم می‌شود. این تقسیم‌بندی می‌تواند توسط دستگاه‌های خاصی انجام شود که امکان تقسیم نمونه به صورت دقیق را فراهم می‌کنند.

2. امپلیفیکیشن:

هر قسمت از نمونه به صورت مجزا امپلیفی می‌شود. این مرحله شامل چندین چرخه امپلیفیکیشن PCR است. هر بخش به طور مستقل امپلیفی می‌شود.

3. اندازه‌گیری سیگنال:

در این مرحله، هر پارت از نمونه بررسی می‌شود و میزان سیگنال فلوئورسانس که نشان‌دهنده وجود یا عدم وجود کپی‌های نوکلئیک‌اسید در هر قسمت است، اندازه‌گیری می‌شود.

بیشتر بخوانید:دستگاه دیجیتال pcr

4. تحلیل داده:

نتایج به تحلیل داده تحت عنوان “موجود” یا “نا موجود” در هر پارت تقسیم می‌شوند. بر اساس نتایج در هر تکه کوچک‌تر، می‌توان تعداد دقیق کپی‌های نوکلئیک‌اسید در نمونه اصلی را محاسبه کرد.

مزایای Digital PCR:

1. دقت بالا: دقت بسیار بالایی دارد و امکان اندازه‌گیری تعداد کمی از DNA یا RNA را با دقت بالا فراهم می‌کند.
2. حساسیت بالا: این روش به دلیل حساسیت بالا حتی تعداد کم DNA یا RNA به وجود آمده در نمونه‌های پرتوشده که با PCR سنتی قابل اندازه‌گیری نیستند، را هم می تواند اندازه گیری کند.
3. کمترین نیاز به استاندارد کالیبراسیون: در مقایسه با روش‌های کمکی مانند qPCR (Quantitative PCR)، Digital PCR نیاز به استاندارد کالیبراسیون کمتری دارد.
4. مقاومت در برابر اثرات تغییرات دما: این روش نسبت به تغییرات دما در طول فرآیند PCR مقاومت بیشتری دارد.

Digital PCR در مطالعاتی که نیاز به اندازه‌گیری دقیق DNA یا RNA با حساسیت بالا دارند، مانند تحقیقات در علوم زیستی، تشخیص بیماری‌ها و مطالعات ژنتیکی، به کار می‌رود. این روش امکان اندازه‌گیری دقیق و کمیت‌گرایانه از نمونه‌های با حجم کم را فراهم می‌کند.

Digital PCR دارای مزایایی نسبت به ریل تایم PCR است، مانند:

• كاهش تاثير عوامل جانبي
• قابليت شناسائي جهش ها و پلي مورفيسم های خيلي كم
• قابليت تشخيص و كمي سازي چندين هدف در يك نمونه
• و همچنین Digital PCR نیاز به منحنی های استاندارد و رفرنس ها برای اندازه گیری مقدار مطلق نوکلئیک اسیدها ندارد، در حالی که qPCR نیاز به نرمال سازی با کنترل ها برای اندازه گیری مقدار نسبی نوکلئیک اسیدها دارد.
• Digital PCR دقت و حساسیت بالاتری نسبت به qPCR دارد و می تواند توالی های کمیاب یا جهش یافته را در میان توالی های طبیعی شناسایی کند، در حالی که qPCR ممکن است تحت تاثیر سیگنال های آزاد شده از توالی های طبیعی قرار گیرد.
• Digital PCR برخلاف qPCR برای تعیین مقدار نوکلئیک اسید الگوی اولیه موجود در نمونه به محاسبه تعداد چرخه ها نیاز ندارد و از تغییرات در بازده فرایند تکثیر تحت تاثیر قرار نمی گیرد.

کاربردهای مهم Digital PCR

• تشخیص و کمیت‌گرایی جهش‌های ژنتیکی:

dPCR می‌تواند جهش‌های نقطه‌ای در DNA را با دقت بسیار بالا تشخیص دهد و تعداد کپی‌های آن‌ها را اندازه‌گیری کند. این برای تشخیص بیماری‌های ژنتیکی مانند سرطان که ممکن است ناشناخته باشد، بسیار مفید است.

• تحقیقات در زمینه سرطان:

در مطالعات سرطان، dPCR برای اندازه‌گیری تعداد کپی‌های ژن‌های مرتبط با سرطان، انجام تجزیه و تحلیل کلونالیته سلول‌های سرطانی و اندازه‌گیری نسبت‌های رشد تومور مورد استفاده قرار می‌گیرد.

• مطالعات اکسپرسیون ژنی:

dPCR برای اندازه‌گیری دقیق اکسپرسیون ژن‌ها در نمونه‌های زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این در تحقیقات در مورد بیان ژن‌ها در سلول‌ها، بافت‌ها، و اندام‌های مختلف بسیار مفید است.

• تشخیص ویروس‌ها و بیماری‌های عفونی:

dPCR در تشخیص ویروس‌ها و بیماری‌های عفونی که ممکن است در نمونه‌های با تعداد کمی از ویروس یا باکتری وجود داشته باشند، مانند HIV و هپاتیت، بسیار کارآمد است.

• تحقیقات در زمینه نانوتکنولوژی:

در تحقیقات مرتبط با نانوتکنولوژی و نانومواد، dPCR برای اندازه‌گیری دقیق تعداد کپی‌های DNA و RNA در ساختارهای نانویی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

• تحقیقات در زمینه زیست‌آزمایی:

در مطالعات مرتبط با تولید دارو، بهینه‌سازی فرآیندهای تولید و کنترل کیفی، dPCR به عنوان یک ابزار مفید برای ارزیابی DNA مورد استفاده قرار می‌گیرد. dPCR در زمینه بیولوژی مولکولی و تحقیقات پزشکی در مطالعات و ارزیابی دقیق نوکلئیک‌اسیدها بسیار ارزشمند است.

کلام آخر:

در این مقاله، شما را با Digital PCR آشنا کردیم و کاربردها و مزایای آن را ذکر کردیم. برای دریافت اطلاعات در مورد دستگاه های Digital PCR مقاله پارت 2 را مطالعه فرمایید و جهت دریافت مشاوره و خرید انواع دستگاه ترمال سایکلر PCR طبق نیاز و بودجه شما، با کارشناسان ما در ماناتک تماس حاصل فرمایید.