استخراج RNA ویروسی

استخراج RNA ویروسی

RNAمولکول

RNA یا اسید ریبونوکلئیک یک مولکول پلیمری است که از واحدهای کوچکتر به نام نوکلئوتیدها تشکیل شده است. هر نوکلئوتید شامل یک قند ریبوز، یک گروه فسفات و یک باز نیتروژنی است. بازهای نیتروژنی موجود در RNA عبارتند از آدنین، گوانین، سیتوزین و یوراسیل. RNA در فرآیندهای بیولوژیکی مختلف مانند کدگذاری، رمزگشایی، تنظیم و بیان ژنها نقش دارد. برخی از انواع RNA عبارتند از:

• RNA پیامرسان: mRNA این نوع RNA الگوی ژنهای DNA را به ریبوزومها منتقل میکند تا پروتئینهای مورد نظر ساخته شوند.
• RNA حامل: tRNA این نوع RNA اسیدهای آمینه را به ریبوزومها حمل میکند تا در فرآیند ترجمه به پروتئینها اضافه شوند.
• RNA ریبوزومی: rRNA این نوع RNA در ساختار و عملکرد ریبوزومها دخالت دارد و به تشکیل پیوندهای پپتیدی بین اسیدهای آمینه کمک میکند.
• RNA هسته ای کوچک: snRNA این نوع RNA در فرآیند پالایش mRNA که حذف بخشهای غیر کدگذار و اتصال بخشهای کدگذار آن است، نقش دارد.
• RNA تداخل: RNAi این نوع RNA به تنظیم بیان ژنها با مهار mRNA کمک میکند.

RNA ویروسی

RNA ویروسی یک مولکول تک رشته ای است که حامل اطلاعات ژنتیکی در برخی از ویروسها مانند کروناویروس، هپاتیت C و HIV است. استخراج RNA ویروسی از نمونه های بالینی مانند خون، بزاق، مایعات بدن و غیره یک مرحله ضروری در تشخیص، پایش و مطالعه این ویروسها است.

برای استخراج RNA ویروسی، سه تکنیک اصلی وجود دارد که عبارتند از:

• روش استخراج بر اساس کلروفرم-فنل: این روش شامل استفاده از محلولهای مبتنی بر فنل-گوانیدین ایزوتیوسیانات (GITC) است که باعث دناتوره شدن پروتئینها و فعال شدن RNase شده و سپس با اضافه کردن کلروفرم، فازهای آبی (حاوی RNA) و عضوی (حاوی DNA و پروتئین) را از هم جدا میکند. در نهایت RNA را با استفاده از الکل چگال شده و تصفیه میکند.

مزایای روش استخراج بر اساس کلروفرم-فنل:

• مناسب برای نمونه های حجیم
• قابل تعمیم برای همه نمونه های بالینی
• حذف کامل DNA و پروتئین
• خالص سازی RNA با خلوص و گیرایی بالا

معایب روش استخراج بر اساس کلروفرم-فنل:

• نقص در تجزیه و تحلیل RNA کوچک
• نقص در تجزیه و تحلیل RNA متیل شده
• نیاز به مواد شیمیایی خطرناک و زمان بر
• احتمال آلودگی با RNase

• روش ستون چرخشی مبتنی بر غشای سیلیکا: این روش شامل استفاده از ستونهای حاوی غشای سیلیکا است که RNA را به خود متصل میکند. ابتدا نمونه با گوانیدین تیوسایانات (GT) گذرانده شده و سپس به ستون اضافه میشود. پس از شستشو با الکل، RNA را با آب گرم DEPC (آب حاوی دای اتیل پیر کاربونات) از ستون الوت میکند.

مزایای روش ستون چرخشی مبتنی بر غشای سیلیکا:

• مناسب برای نمونه های کوچک و کم حجم
• ساده و سریع
• حذف کامل DNA و پروتئین
• خالص سازی RNA با خلوص و گیرایی بالا

  معایب روش ستون چرخشی مبتنی بر غشای سیلیکا:

• نقص در تجزیه و تحلیل RNA کوچک
• نقص در تجزیه و تحلیل RNA متیل شده
• نیاز به مواد مصرفی گران قیمت

• روش با استفاده از ذرات مغناطیس: این روش شامل استفاده از ذرات پارامغناطیس است که RNA را به خود جذب میکند. در این روش، نمونه با لیرز lysis بافر حاوی گوانیدین هیدروکلراید GHC) )گذرانده شده و سپس به ذرات مغناطیس اضافه میشود. پس از جداسازی ذرات با قطب مغناطیس، RNA را با الکل شستشو داده و در نهایت با آب DEPC الوت میکند.

مزایای روش با استفاده از ذرات مغناطیس:

• مناسب برای نمونه های کوچک و کم حجم
• ساده و سریع
• حذف کامل DNA و پروتئین
• خالص سازی RNA با خلوص و گیرایی بالا
• قابل اتوماسیون و انجام در دستگاه های خودکار

بیشتر بخوانید:دستگاه دیجیتال pcr

 معایب روش با استفاده از ذرات مغناطیس:

• نقص در تجزیه و تحلیل RNA کوچک
• نقص در تجزیه و تحلیل RNA متیل شده
• نیاز به دستگاه های پارامغناطیس

این روشها هر کدام مزایا و معایب خود را دارند. برخی از عوامل تاثیرگذار بر انتخاب روش مناسب عبارتند از:

• نوع و منبع نمونه: نمونه های متفاوتی از جمله خون، بزاق، بافت وجود دارد.
• کمیت و کیفیت RNA مورد نظر: بستگی به هدف تحقیقاتی و تکنولوژی مورد استفاده دارد که چقدر RNA با خلوص و یکنواختی بالا نیاز داریم.
• هزینه و زمان: برخی روشها نسبت به دیگران ارزانتر و سریعتر هستند، اما ممکن است کیفیت پایین تری داشته باشند.
• تجهیزات و مواد مصرفی: برخی روشها نیاز به دستگاههای پیچیده و گرانقیمت مانند قطب مغناطیس یا سانتریفیوژ دارند، در حالی که برخی دیگر با استفاده از مواد شیمیایی ساده قابل انجام هستند.

معرفی کیت های استخراج RNA ویروسی ستونی شرکت ماناتک:

این محصول می تواند RNA ویروسی را از نمونه های مایع بیولوژیکی پلاسما، سرم، بزاق و نمونه بینی استخراج کند ولی از خون نمی تواند و حداکثر حذف پروتئین و سایر ناخالصی های ترکیب آلی را تضمین می کند. RNA ویروسی استخراج شده را می توان مستقیما برای فرایندهایی از جملهqRT-PCR   وRT-PCR  استفاده کرد. مقدار اسید نوکلئیک ویروسی خالص شده به نوع و منبع نمونه، تیتر ویروس و شرایط نگهداری و سن بستگی دارد.

مراحل  انجام استخراج RNA ویروسی با کیت ماناتک:

1. 150 لاندا سرم یا پلاسما و اضافه کردن 200 لاندا محلول RVLB و 10 لاندا پروتئیناز K و به مدت 15 دقیقه در دمای 58 انکوبه می شود.
2. اضافه کردن 400 لاندا اتانول به ستون و به مدت2 دقیقه انکوبه شود.
3. به مدت 2 دقیقه در دور 8000 سانتریفیوژ کنید و محلول رویی را دور بریزید.
4. 300 لاندا از محلول RVWB1 اضافه کرده و به مدت 2 دقیقه در دور 11000 سانتریفیوژ کنید و محلول رویی را دور بریزید
5. 300 لاندا از محلول RVLWB2 اضافه کرده و به مدت 2 دقیقه در دور 11000 سانتریفیوژ کنید و محلول رویی را دور بریزید
6. ستون را در میکروتیوب الوشن ریخته و 40 لاندا از محلول RVEB اضافه کرده و به مدت 2 دقیقه انکوبه کنید و در نهایت به مدت 2 دقیقه در دور 12000 سانتریفیوژ کنید و اکنون RNA خالص تهیه شده است.

از جمله مزیت های کیت های شرکت ماناتک:

نیمه عمر بالای کیت، خدمات پس از فروش و بکارگیری ترکیبات شیمیایی سازگار با مواد زیستی جهت حذف آلودگی های RNA

شما میتوانید برای خرید محصول مناسب با پروژه خودتان پس از مطالعه متن بالا با کارشناسان حرفه ای ما مشورت کنید. شرکت ماناتک انواع کیت های استخراج ستونی را برای سهولت و تسریع  در  کار شما با قیمت مناسب و کیفیت بالا در اختیار شما میگذارد.