تاریخچه توالی یابی
توالی یابی یک روش برای تعیین ترتیب نوکلئوتیدهای DNA یا RNA است که اطلاعات ژنتیکی را رمز می کنند. توالی یابی می تواند برای شناسایی و مقایسه ژن ها، پروتئین ها، موجودات زنده و بیماری های ژنتیکی و عفونی مورد استفاده قرار گیرد. تاریخچه توالی یابی به سال ۱۹۵۳ بر می گردد که جیمز واتسون و فرانسیس کریک ساختار مارپیچ دوگانه DNA را کشف کردند. از آن زمان به بعد، روش های مختلف و پیشرفته تری برای تعیین توالی DNA و RNA طراحی و ابداع شده اند. توالی یابی سانگر که به عنوان روش پایان زنجیره ای نیز شناخته می شود، تکنیکی است که توسط فردریک سانگر در سال 1977 برای تعیین توالی نوکلئوتیدی DNA توسعه یافت. این روش اولیه مورد استفاده در نسل اول توالی یابی DNA بود و نقش مهمی در تعیین توالی ژنوم انسان ایفا کرد.
روش سنگر و فرایند توالی‌یابی سنگر
در این روش، DNA را با استفاده از آنزیم DNA پلیمراز و نوکلئوتیدهای خاتمه زنجیره (ddNTPs) کپی می کنند. این نوکلئوتیدها باعث متوقف شدن رشد زنجیره DNA در نقاط مختلف می شوند و زنجیره های کوتاه با طول های مختلف تولید می کنند. سپس، با استفاده از ژل الکتروفورز، زنجیره های DNA را براساس طول جدا می کنند و با استفاده از رادیواکتیو یا فلورسانس، ترتیب نوکلئوتیدهای آخر هر زنجیره را مشخص می کنند. در رویکرد توالی‌یابی سانگر، DNA تقویت‌شده یا DNA مکمل (cDNA) به یک آغازگر الیگونوکلئوتیدی متصل می‌شود و سپس توسط آنزیم DNA پلیمراز گسترش می‌یابد که ترکیبی از 4 تری فسفات دئوکسی‌نوکلئوتید: dNTPs dATP)، dGTP، dCTP،(dTTP یا دی داکسی نوکلئوتید تری فسفات پایان دهنده زنجیرهddNTPs): ddATP ، ddGTP، ddCTP،ddTTP ) گنجاندن غلظت‌های محدودکننده سرعت ddNTP ها، واکنش ازدیاد طول را متوقف میکند، زیرا ddNTPs ترکیب می‌شوند و در نتیجه قطعات DNA قابل تشخیص با طول‌های مختلف ایجاد می‌شود. فرایند توالی یابی سنگر فعلی عموماً از تولید توالی های NA تا 800-1000 جفت باز پشتیبانی می کند. به طور معمول، مهم‌ترین محدودیت‌های این رویکرد، توالی‌های با کیفیت پایین در 15 تا 40 جفت باز اول به دلیل اتصال پرایمر، و ناتوانی در تشخیص تفاوت‌های تک جفت باز در بخش‌های طولانی‌تر هستند (به عنوان مثال، بیش از 900 جفت باز). توجه به این محدودیت ها، چه تجاری و چه غیرتجاری نرم افزار تجزیه و تحلیل توالی به تکامل خود ادامه می دهد تا به کاربر کمک کند تا داده های با کیفیت پایین را به طور خودکار ارزیابی و برش دهد.
مراحل توالی‌یابی سنگر به صورت زیر انجام می‌شود:
1.تکه تکه شدن DNA: DNA که باید توالی یابی شود ابتدا به قطعات کوچکتر تقسیم می شود.
2. پرایمر انلینگ: یک قطعه DNA کوتاه و تک رشته ای که به عنوان پرایمر شناخته می شود، به DNA الگو متصل می شود. این آغازگر به عنوان نقطه شروع برای سنتز رشته DNA جدید عمل می کند.
3.سنتز DNA: مخلوط ویژه ای تهیه می شود که شامل چهار نوکلئوتید DNA (آدنین، تیمین، سیتوزین و گوانین)، آنزیم DNA پلیمراز و یک پرایمر است. پلیمراز با افزودن نوکلئوتیدهای مکمل به رشته الگو شروع به سنتز رشته DNA جدید از پرایمر می کند.
4. ترکیب دیدئوکسی نوکلئوتیدها: کلید روش سانگر گنجاندن دی اکسی نوکلئوتیدها (ddNTPs) در مخلوط است که اشکال اصلاح شده نوکلئوتیدهای DNA هستند. این ddNTP ها فاقد یک گروه هیدروکسیل روی کربن 3 هستند، این ویژگی از افزودن یک نوکلئوتید دیگر پس از ادغام یک ddNTP در رشته DNA جلوگیری می کند. این منجر به قطع زنجیره می شود.
5. تولید طیفی از قطعات DNA: واکنش سنتز DNA در چهار لوله مجزا انجام می شود که هر کدام شامل یکی از چهار ddNTP مختلف است. همانطور که پلیمراز رشته DNA جدید را سنتز می کند، گاهی اوقات به جای نوکلئوتید معمولی، یک ddNTP را ترکیب می کند. این منجر به قطعاتی با طول های مختلف می شود که هر کدام به ddNTP خاص آن لوله ختم می شود.
6. الکتروفورز و تجزیه و تحلیل: سپس قطعات DNA از طریق الکتروفورز مویرگی بر اساس اندازه جدا می شوند. طول هر قطعه مربوط به موقعیت یک نوکلئوتید در توالی است. به طور سنتی، هر یک از ddNTP ها با رنگ فلورسنت متفاوتی برچسب‌گذاری می‌شوند، که اجازه می‌دهد توالی با لیزر و کامپیوتر هنگام عبور قطعات خوانده شود. خروجی مجموعه ای از پیک ها در کروماتوگرام است که هر کدام یک نوکلئوتید در دنباله را نشان می دهند. با خواندن پیک ها به ترتیب می توان توالی قطعه DNA را تعیین کرد. در حالی که امروزه به دلیل ظهور روش‌های توالی‌یابی سریع‌تر و ارزان‌تر نسل بعدی، توالی‌یابی سانجر کمتر رایج است، اما برای اعتبارسنجی توالی‌های DNA و در کاربردهایی که دقت بالایی برای توالی‌های DNA کوتاه مورد نیاز است، مهم است.
این روش دارای مزایا و معایب زیر است:
مزایا
- دقت بالا در تعیین توالی DNA
- قابل استفاده بودن برای نمونه های کم حجم و کم کیفیت
- قابل استفاده بودن برای تایید نتایج توالی یابی نسل بعد (NGS)
- قابل استفاده بودن برای تعیین توالی پلاسمید، جهش، درج و حذف
معایب:
- سرعت پایین و هزینه بالا در مقایسه با NGS
- نمونه گیری و پروسسینگ پیچیده و زمانبر
- ناتوان در تعیین توالی ناحیه های پرتکرار و GC-rich
- ناتوان در تعیین تغییرات ساختار ژنوم
معرفی دو روش NGS و نانوپور و مقایسه با تکنیک سنگر
روش توالی یابی نسل بعدی (NGS)
روش توالی‌یابی نسل بعدی یا NGS (Next Generation Sequencing) یک تکنولوژی پیشرفته در زمینه بیولوژی مولکولی است که به دقت بسیار بالا توالی DNA و RNA را می‌خواند. در مقایسه با روش‌های سنتی توالی‌یابی مانند روش سنگر، NGS قادر به همزمان توالی‌یابی میلیون‌ها قطعه DNA مختلف در یک زمان است. این تکنیک با امکانات بالای توالی‌یابی و تحلیل داده‌ها، اطلاعات زیستی بسیار جزئی و جامعی از ساختار ژنوم هر ارگان فراهم میکند. یکی از ویژگی‌های بارز NGS توانایی انجام توالی‌یابی با سرعت بالا و هزینه کمتر نسبت به روش‌های قدیمی است. این امکان به محققان اجازه می‌دهد تا تغییرات ژنومی مرتبط با بیماری‌ها، تکامل و سایر فرایندهای زیستی را با دقت بیشتری بررسی کنند. همچنین، NGS در تحقیقات بیولوژی سلولی و مولکولی، زیست‌اطلاعاتی، مطالعات تکاملی و جدیدترین شاخه‌های پزشکی از جمله پزشکی شخصی (پزشکی دقیق) بسیار مؤثر است. این تکنولوژی امکانات مهمی برای تحقیقات داروسازی، توالی‌یابی RNA و تحلیل ژن‌های انفرادی را نیز فراهم میکند.
روش توالی یابی نانوپور
بیشتر بخوانید:دستگاه دیجیتال pcr
توالی یابی نانوپور یک روش نسل سوم توالی یابی DNA یا RNA است که بدون نیاز به تقویت PCR یا برچسب زدن شیمیایی، میتواند توالی یک مولکول واحد را تعیین کند. این روش از چگالی جریان الکتریکی در سراسر یک ساختار نانوپور برای شناسایی تغییرات میدان الکتریکی به دلیل ورود نوکلئوتیدهای مختلف به درون آن استفاده میکند. این روش دارای پتانسیل ارائه ژنوتیپ کم هزینه، تحرک زیاد، پردازش سریع و نمایش نتایج در زمان واقعی است. این روش در شناسایی سریع پاتوژن های ویروسی، نظارت بر محیط زیست، توالی ژنوم انسان و گیاه، مانیتورینگ مقاومت آنتی بیوتیک و برنامه های دیگر کاربرد دارد.
مقایسه تکنیک Sanger با متد NGS
این دو روش در اصول، سرعت، دقت، هزینه و کاربردهای خود با هم تفاوت دارند. به طور خلاصه می توان گفت: تکنیک Sanger بر اساس استفاده از نوکلئوتیدهای دیدئوکسی (ddNTP) که باعث متوقف شدن سنتز DNA می شوند، کار می کند. سپس زنجیره های تولید شده با الکتروفورز ژل جداسازی و با استفاده از رادیواکتیویته یا فلورسانس شناسایی می شوند. این روش برای توالی یابی قطعات بلند و مجزای DNA مناسب است، اما برای پروژه های بزرگتر و پیچیده تر مانند توالی یابی کل ژنوم یا متاژنوم کارآمد و اقتصادی نیست. روش های NGS قادر هستند با استفاده از فن آوری های پیشرفته، هزاران تا میلیون ها قطعه DNA را به صورت همزمان و با سرعت و دقت بالا توالي يابي كنند. این روش ها به دو دسته اصلی تقسيم مي شوند: توالي يابي جريان خروجي (SBS) و توالي يابي جريان ورودي (SIS). در روش SBS، قطعات DNA به صورت تک رشته اي به يك سطح ثابت (چيپ) متصل مي شوند و با استفاده از نور فلورسانس، بازهاي آنها خوانده مي شود. در روش SIS، قطعات DNA به صورت دو رشته اي به يك سطح حساس به الكتروفورز (پور) متصل مي شود و با استفاده از جريان الكتريكي، بازهاي آنها خوانده مي شود. این روش ها برای تولید و تحليل حجم زیادی از داده های توالي يابي مناسب هستند، اما نسبت به روش Sanger پیچیده تر و گران قیمت تر هستند.
مقایسه توالی یابی سنگر و نانوپور
در توالی یابی نانوپور، از ddNTP استفاده نمی شود. در توالی یابی سنگر، ddNTP ها باعث متوقف شدن واکنش پلیمریزاسیون DNA می شوند و نقش برچسب را برای تشخیص توالی بازها دارند. اما در توالی یابی نانوپور، هیچ برچسب شیمیایی یا PCR لازم نیست. در این روش، فقط یک مولکول DNA یا RNA به صورت تک رشته از طریق یک سوراخ کوچک به نام نانوپور عبور می کند و باعث تغییر جریان الکتریکی در آن می شود. این جریان الکتریکی بسته به نوع نوکلئوتید که در حال عبور است، متفاوت است و می توان با تجزیه و تحلیل آن، توالی مولکول را بدست آورد.
کلام آخر:
در این مقاله، برای شما تکنیک توالی یابی سنگر توضیح داده شد و با سایر تکنیک های توالی یابی مقایسه شد. برای دریافت خدمات تخصصی مولکولی و خرید انواع دستگاه ترمال سایکلر PCR با کارشناسان مجرب ما در ماناتک تماس حاصل فرمایید.
