آموزش تکنیک HRM برای شناساسی ژنوتیپ و جهش ها

High Resolution Melting (HRM)

تکنیک HRM (High Resolution Melt) یک روش قدرتمند و مقرون به صرفه برای شناسایی ژنوتیپ ها و جهش ها (پلیمورفیسم یا SNP) است. این روش با استفاده از یک رنگ فلوئورسنت به نام Eva Green کار می کند که به DNA دو رشته ای باند می شود و با افزایش دما، رشته های DNA از هم جدا شده و سطح فلورسانس کاهش می یابد. با بررسی تغییرات در منحنی ذوب فلورسانس، می توان جهش ها و پلی مورفیسم های DNA را شناسایی کرد. در این روش، ابتدا نمونه DNA بوسیله PCR سنتز می شود.

سپس دما از حدود 70 تا 95 درجه به صورت تدریجی افزایش می یابد و با هر بار افزایش دما، میزان سیگنال فلورسنت اندازه گیری می شود. در زمان رسیدن به نقطه ذوب (Tm)، محصول PCR دو رشته DNA کاملا از هم جدا شده و سیگنال به طور شدیدی افت پیدا می کند.

تفاوت های تک نوکلئوتیدی در توالی یک نمونه نسبت به نمونه دیگر زمان افت سیگنال اندکی متفاوت می باشد و بنابراین از این طریق می توان به تفاوت های تک نوکلئوتیدی در رشته DNA پی برد. تغییرات سیگنال فلورسانس توسط یک منحنی نشان داده می شود. هر تغییری در توالی DNA، منجر به تغییر منحنی HRM می شود و با مقایسه با نمونه کنترل می توان به نتایج ارزشمندی دست یافت.

کاربردهای HRM عبارتند از:

– تشخیص تنوع ژنتیکی: HRM به عنوان یک روش سریع و قابل اعتماد برای تشخیص تنوع ژنتیکی در نمونه‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد. این تکنیک در بیولوژی مولکولی، طب پیشگیری و درمانی، تحقیقات سرطان، و تحقیقات در زمینه بیماری‌های عفونی و بسیاری دیگر از زمینه‌های پزشکی و بیولوژیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

– تشخیص موتاسیون‌های DNA: HRM به عنوان یک روش سریع و دقیق برای تشخیص موتاسیون‌های DNA در نمونه‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد. این تکنیک باعث بهبود تشخیص موتاسیون‌های DNA در بیماران با بیماری‌های ژنتیکی می‌شود.

– مطالعه رشته‌های DNA: HRM به عنوان یک روش سریع و دقیق برای مطالعه رشته‌های DNA مورد استفاده قرار می‌گیرد و در تحقیقات بنیادی و تحقیقات در زمینه بیولوژی مولکولی به کار می‌رود.

با استفاده از تکنیک HRM می توان ژنوتیپ های مختلف را تشخیص داد و افراد را بر اساس ژنوتیپشان دسته بندی کرد. در این روش، تفاوت بین ژنوتیپ ها از طریق تفاوت در منحنی ذوب مشخص می شود. به عنوان یک روش جدید، HRM هزینه کمتری دارد و سرعت و دقت بالایی دارد.

از دیگر کاربردهای HRM برای شناسایی ژنوتیپ و جهش ها، می توان به شناسایی وجود جهش ها در توالی مورد نظر نسبت به توالی مرجع، شناسایی جهش های جدید در توالی مورد، شناسایی نقاط متیله در توالی مورد نظر نسبت به توالی مرجع، گروه بندی افراد بر حسب ژنوتیپ یک توالی مورد نظر، تعیین کلاد افراد و خوشه بندی جمعیت های مختلف اشاره کرد.

کاربردها در تشخیص بیماری ها

HRM برای تشخیص بیماری‌های خاصی مورد استفاده قرار می‌گیرد. به عنوان مثال، در زمینه بیماری‌های ژنتیکی، HRM می‌تواند به عنوان یک روش سریع و دقیق برای تشخیص موتاسیون‌های DNA در بیماران با بیماری‌های ژنتیکی مانند بیماری‌های سندرم داون، بیماری هانتینگتون، بیماری سل‌های چربی و بسیاری دیگر از بیماری‌های ژنتیکی مورد استفاده قرار بگیرد. (برای مطالعه مقاله ناهنجاری های ژنی بر روی کلمه، کلیک فرمایید.)

همچنین، HRM به عنوان یک روش سریع و دقیق برای تشخیص بیماری‌های عفونی مانند ویروس هپاتیت C، ویروس هرپس ساده، و همچنین برای تشخیص بیماری‌های سرطانی مانند سرطان سینه و سرطان پروستات نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد. بنابراین، HRM به عنوان یک روش تشخیصی قابل اعتماد و دقیق در تشخیص بیماری‌های مختلف در زمینه پزشکی و بیولوژیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

بیشتر بخوانید:دستگاه دیجیتال pcr

نحوه عملکرد HRM و پروسه تغییر دما

درHRM، پروسه تغییر دما به منظور تبدیل دو رشته‌ی DNA دوقطبی (double-stranded) به دو رشته‌ی DNA تنها قطبی (single-stranded) صورت می‌گیرد. این تغییر دما باعث جداسازی دو رشته‌ی DNA از هم و تشکیل دو رشته‌ی تک‌قطبی می‌شود.

سپس در دمای بالاتر، دو رشته‌ی تک‌قطبی از هم جدا شده و در دمای پایین‌تر دوباره به یکدیگر متصل می‌شوند. پس از جداسازی دو رشته‌ی DNA از هم، تغییرات در ساختار DNA با استفاده از دستگاه HRM تشخیص داده می‌شود. در واقع، HRM از تغییرات در رفتار دو رشته‌ی DNA تک‌قطبی با دما به عنوان یک نشانگر برای تشخیص تنوع ژنتیکی و موتاسیون‌های DNA استفاده می‌کند.

تغییر دمای HRM به صورت دقیق و به شکلی که دو رشته‌ی DNA به طور کامل از هم جدا شوند و تغییرات در ساختار DNA با دقت تشخیص داده شوند، انجام می‌شود. هدف اصلی این تغییر دما در HRM، به دست آوردن اطلاعات دقیق در مورد تغییرات در ساختار DNA و تشخیص تنوع ژنتیکی و موتاسیون‌های DNA در نمونه‌های مختلف است. به عبارت دیگر، هدف اصلی HRM، تشخیص دقیق و سریع تغییرات در DNA است که می‌تواند در تشخیص بیماری‌ها و تحقیقات در زمینه بیولوژی مولکولی و ژنتیکی مفید باشد.

مهم ترین دستگاه های ریل تایم دارای HRM:

 QIAGEN Rotor-Gene Q 5plex HRM: این دستگاه یک دستگاه روتور ژن است که قابلیت تکثیر و تشخیص DNA با استفاده از پنج کانال فلورسانس و یک کانال HRM را دارد. این دستگاه سرعت بالا، دقت بالا، قابل حمل بودن و قابل تطبیق بودن با روش های مختلف را دارد.

Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR : این دستگاه قابلیت تکثیر و تشخیص DNA با استفاده از شش کانال فلورسانس و HRM را دارد. این دستگاه حساسیت بالا، خاص بودن، قابل کمی سازی بودن و قابل اتصال به نرم افزار CFX Manager™ Software را دارد.

BMS MIC Real-Time PCR System: این دستگاه قابلیت تکثیر و تشخيص DNA با استفاده از دو و چهار كانال فلورسانس و HRM را دارد. این دستگاه سرعت بالا، دقت بالا، قابل حمل بودن و وزن بسیار کمی دارد.

Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System : این دستگاه قابلیت تکثیر و تشخيص DNA با استفاده از شش كانال فلورسانس و HRM را دارد. این دستگاه سادگي، كارآيي، قابليت نصب آسان و قابليت ارتقاء به QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR System را دارد.

کلام آخر:

ما در این مقاله برآن شدیم تا تکنیک HRM و انواع کاربردها و نحوه عملکرد را توضیح داده، و همچنین مهم ترین دستگاه های ریل تایم دارای HRM را به شما معرفی کردیم . برای خرید و مشاوره انواع دستگاه ریل تایم pcr با کارشناسان مجرب ما در ماناتک تماس حاصل فرمایید.