استخراج DNA از گیاهان
استخراج DNA از گیاهان، فرایندی است که طی آن DNA را از نمونه های بافت گیاهی به روشهای فیزیکی و شیمیایی جداسازی و خالص سازی میکنند. این فرایند برای بررسی تنوع ژنتیکی، اصلاح نژاد، تشخیص بیماریها با متدPCR و کاربردهای دیگر در بیولوژی مولکولی و کشاورزی مفید است.
تاریخچه استخراج DNA در گیاهان
- اولین بار استخراج DNA در گیاهان در سال ۱۹۶۳ توسط دانشمندان انگلیسی به نامهای Robert B. Flavell و John B. Ohlrogge انجام شد. آنها با استفاده از یک روش که شامل لیز سلولی با حرارت و تصفیه با فنل و کلروفرم بود، DNA را از برگهای گیاه Arabidopsis thaliana جداسازی کردند. این گیاه یک مدل مطالعاتی در زمینه ژنتیک گیاهان است.
- در سال ۱۹۷۲، دانشمندان آمریکایی به نام های Robert A. Martienssen و James A. Birchler موفق به استخراج DNA از گیاهان دارای سلول های مقاوم به نور شدند. آنها با استفاده از یک روش که شامل لیز سلولی با حرارت و تصفیه با فنل و کلروفرم بود، DNA را از بذرهای گیاه Zea mays جداسازی کردند. این گیاه یک مدل مطالعاتی در زمینه تکامل ژنوم گیاهان است.
تاریخچه استفاده از PCR در بررسی ژنتیک گياهان
اولین بار استفاده از PCR در بررسی ژنتیک گیاهان در سال ۱۹۸۸ توسط دانشمندان آمریکایی به نامهای Randall A. Lira و Jeffrey D. Palmer انجام شد. آنها با استفاده از PCR، DNA میتوکندریایی گیاهان را تکثیر و تحلیل کردند. آنها نشان دادند که DNA میتوکندریایی گیاهان دارای تنوع بالایی است و میتواند برای مطالعه تکامل و فیلوژنتیک گیاهان مورد استفاده قرار گیرد.
در سال ۱۹۹۰، دانشمندان آمریکایی به نامهای Alec J. Jeffreys و David S. Weissman موفق به استفاده از PCR در بررسی DNA کلروپلاستی گیاهان شدند. آنها با استفاده از PCR، DNA کلروپلاستی گیاهان را تکثیر و تحلیل کردند. آنها نشان دادند که DNA کلروپلاستی گیاهان دارای تکرارهای مینی ساتلایت است که میتوانند برای شناسایی و تمایز گونه ها و جمعیت های گیاهان مورد استفاده قرار گیرند.
برای استخراج DNA از گیاهان به صورت دستی، معمولاً چند مرحله زیر طی می شود:
- جمع آوری و آماده سازی نمونه ( و لیز سلول): در این مرحله، بافت گیاهان تازه یا خشک را جمع آوری و خرد کرده و با نمک، شوینده و پروتئیناز مخلوط میکنند. این کار باعث شکستن سلولها و آزاد شدن DNA میشود.
- خالص سازی: DNA در این مرحله، DNA را از بقایای سلول و آلودگی های دیگر جداسازي مي كنند. این کار با استفاده از الکل و فنل-کلروفرم انجام مي شود.
- تغليظ و حلاليت : DNA در این مرحله، DNA را از حالت حل شده آزاد کرده و در یک حجم کمتر حل مي كنند. این کار با استفاده از الکل، نمک یا روش های ديگر انجام مي شود.
- اندازه گیري خلوص و غلظت: DNA در این مرحله، کيفيت و کميت DNA را با استفاده از طيف سنج جذب UV، الکتروفورز ژل يا روش های ديگر بررسي مي كنند.
چند نمونه از روش های استخراج DNA
- روش CTAB : این روش یک روش استاندارد و قدیمی برای خالص سازي DNA است. در این روش، CTAB (ستيل تري متيل آمونيوم برومايد) به عنوان شوینده و پروتئین دناتوره protein denaturant) ) استفاده مي شود. CTAB با پروتئین های سلول و هسته تعامل دارد و آن ها را دناتوره مي كند. سپس با فنل-کلروفرم يا الكل، DNA را جداسازي و رسوب مي دهند.
- روش ستونی: این روش یک روش مدرن و سریع برای خالص سازي DNA است. در این روش، ستون های تخلص که دارای ماده جاذبی هستند که با DNA تعامل دارند، استفاده میشوند. عصاره سلول را به ستون اضافه میکنیم و با قرار دادن در چرخشگر، DNA را به ماده جاذب متصل میکنیم. سپس با شستشو با بافرهای مناسب، آلودگیها را از ستون برداشته و در نهایت با یک بافر قلیایی یا آب، DNA را از ستون آزاد میکنیم.
- روش دانه های مغناطیسی: این روش یک روش نوین و کارآمد برای خالص سازي DNA است. در این روش، دانه های مغناطيسي که دارای گروههای عاملی هستند که با DNA تعامل دارند، استفاده میشوند. عصاره سلول را به دانه های مغناطيس اضافه میکنیم و با قرار دادن در یک میدان مغناطيس، DNA را به دانه ها متصل میکنیم. سپس با شستشو با بافرهای مناسب، آلودگیها را از دانه ها برداشته و در نهایت با حذف میدان مغناطيس و یک بافر قلیایی یا آب، DNA را از دانه ها آزاد میکنیم.
استخراج DNA از گیاه یک فرایند پیچیده و حساس است که نیاز به رعایت شرایط خاص و روش های مناسب دارد. برخی از موانع و چالشهای این فرایند عبارتند از:
- وجود ترکیبات آلاینده در بافت گیاهی: بسیاری از گیاهان دارای متابولیت های ثانویه هستند که ممکن است با DNA تعامل داشته باشند و کیفیت و کمیت آن را کاهش دهند. برخی از این ترکیبات عبارتند از پلیفنول ها، تانن ها، پلی ساکاریدها، پروتئین ها، پکتین ها و لیگنین ها. این ترکیبات ممکن است با DNA چسبیده شوند، آن را تجزیه کنند، یا با عملکرد آنزیمهای مورد نیاز برای کاربردهای مولکولی مانند PCR یا تعیین توالی تداخل داشته باشند.
- سخت بودن خرد کردن بافت گیاهی: برخی از گیاهان دارای دیواره سلولی ضخیم و سخت هستند که نمونه برداری و لیز سلول را دشوار میکنند. برای شکستن این بافتها، ممکن است نیاز به استفاده از نیتروژن مایع، آسپیراتور، هموژنایزر، bead beater و یا روشهای دیگر باشد که هزینه، زمان و تجهیزات خاص را مطلب میکنند.
- نگهداری و حفظ نمونه گیاه: برخلاف نمونه های حیوان، نمونه برداري از گياهان در شرایط خشک و در دمای محيطي قابل اجراء است. با این حال، برای جلوگیري از تغييرات DNA در نمونه های خشك شده يكي از روش های زير را باید پيش بيني كرد:
الف) استفاده از نمونه های خشك شده در زمان كوتاه پس از جمع آوري.
بیشتر بخوانید:استخراج DNA آزاد سلولی
ب) نگهداري نمونہ های خشك شده در فضای خالي از هوا ( vacuum)يكسان سازي فشار
ج) استفاده از عصاره سلول يكسان ساز homogenizer) ) در زمان جمع آوري نمونه.
د) استفاده از مواد محافظ DNA مانند EDTA یا CTAB در زمان جمع آوری نمونه.
روش های جدید و نوین برای استخراج DNA از گیاهان
- روش CTAB-spin: این روش توسط گروه پژوهشگران روس در سال ۲۰۲۳ ارائه شده است. در این روش، DNA با استفاده از روش CTAB که یک روش ارزان و معمول است، استخراج میشود. سپس با استفاده از ستونهای چرخان spin columns) ) که دارای سیلیکا هستند، DNA را پالایش میکنند. این روش مناسب برای آماده سازی کتابخانه های DNA برای تحلیل متا آنالیزmetagenomic analysis) ) است.
- روش NIB : این روش توسط گروه پژوهشگران آمریکایی در سال ۲۰۲۰ ارائه شده است. در این روش، هسته های سلول گیاه با استفاده از سنگ زنیgrinding فیزیکی و بافر NIB (Nuclear Isolation Buffer) که دارای ماده جذب کننده DNA هستند، جداسازي مي شود. سپس با شستشو با بافر تغيير فشار (osmotic buffer)، DNA های پلاستید plastid DNAs) که از آلودگي هستند، حذف مي شود. در نهايت با ليز كردن هستہ ها و خالص سازي با استخراج آلي (organic extraction)، DNA با كيفيت بالا و حجم كم استخراج مي شود. اين روش مناسب براي سكانسينگ نسل سوم و نقشه برداري نوري است.
- روش SDS-spin: این روش توسط گروه پژوهشگران فرانسوی در سال ۲۰۱۶ ارائه شده است. در این روش، DNA با استفاده از بافر SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) که یک شوینده و دناتور پروتئینprotein denaturant) ) است، استخراج میشود. سپس با استفاده از دانه های مغناطیسی که دارای گروههای عاملی هستند که با DNA تعامل دارند، DNA را پالایش میکنند. این روش ساده و سریع است و تنها ۱.۵ ساعت زمان میبرد.
استخراج DNA از گیاه با روش فنول- کلروفرم
- در مرحله لیز سلول، برای جلوگیری از تجزیه DNA توسط آنزیمهای نوکلئاز که ممکن است در بافت گیاهی وجود داشته باشند، ممکن است نیاز به استفاده از EDTA یا بتامرکاپتواتانول (beta-mercaptoethanol) باشد. این مواد باعث میشوند که فعالیت آنزیمهای نوکلئاز را کاهش دهند و DNA را حفظ کنند.
- در مرحله خالص سازی DNA، برای جداسازی DNA از پلی فنولهای گیاهان، ممکن است نیاز به استفاده از پروتئین کیناز K (proteinase K) یا پروتئین A (protein A) باشد. این مواد باعث میشوند که پروتئینهای متصل به پلی فنولها را هضم کنند و DNA را از آلودگی آنها آزاد کنند.
- در مرحله تغليظ و حلاليت DNA، برای حفظ pH مناسب برای DNA، ممکن است نیاز به استفاده از تريس یا sodium acetate باشد. این مواد باعث میشوند که pH را در حدود ۷ تا ۸ نگہ دارند و جذب UV DNA را بهبود بخشند.
(اگر در پروژه خود، گیاه خاصی دارید و قصد استخراج از DNA آن را دارید، میتوانید با مشاوران ما تماس حاصل فرمایید. شرکت ماناتک تولید کننده انواع کیت های استخراج با کیفیت بالا و قیمت مناسب در اختیار شما اساتید و دانشجویان عزیز می باشد.).
