دستگاه دیجیتال pcr

تاریخچه سیستم‌های دستگاه دیجیتال pcr به اوایل دهه 1990 باز می‌گردد و نقاط عطف مهمی را در زمینه بیولوژی مولکولی نشان می‌دهد. دیجیتال PCR نماینده پیشرفت قابل توجه در دقت و حساسیت کمیت‌سنجی DNA است. مفهوم dPCR اولین بار در سال 1992 توسط دکتر برت واگلشتاین و دکتر کنت کینزلر توصیف شد. آنها روشی برای کمیت‌سنجی مطلق اسیدهای نوکلئیک با تقسیم‌بندی نمونه به تعداد زیادی واکنش‌های PCR مجزا پیشنهاد کردند. سیستم‌های دیجیتال PCR قطره‌ای (ddPCR) نیز نماینده پیشرفت قابل توجهی در زمینه کمیت‌سنجی اسیدهای نوکلئیک هستند. این فناوری روشی بسیار دقیق برای اندازه‌گیری غلظت مطلق مولکول‌های DNA یا RNA را با تقسیم نمونه به هزاران قطره با اندازه نانولیتری ارائه می‌دهد.

از این تکنیک برای تشخیص جهش‌های نادر، نظارت بر بیماری باقیمانده حداقلی و کمیت‌سنجی جهش‌ها در تحقیقات سرطان استفاده می‌شود. در تشخیص عوامل بیماری‌زا، تحلیل بار ویروسی و کاربردهای بیوپسی مایع مفید است. در تحلیل بیان ژن، تغییرات تعداد کپی و تشخیص GMOها به کار رفته است. همچنین برای تشخیص و کمیت‌سنجی عوامل بیماری‌زا یا توالی‌های خاص DNA/RNA در نمونه‌های محیطی استفاده می‌شود.

پروسه و فرایند دیجیتال PCR

PCR دیجیتال نسل جدیدی از PCR کمی (qPCR) است که برای کمی‌سازی مطلق اسیدهای نوکلئیک هدف استفاده می‌شود. در یک آزمایش دیجیتال، نمونه به چندین بیوراکتور کوچک تقسیم می‌شود، که هر کدام از آن‌ها صفر یا یک یا دو (یا سه، چهار و غیره) نسخه از اسیدهای نوکلئیک هدف را دارند. هر قطره دارای یک ناحیه محفظه بندی شده خاص است که از آلودگی متقابل بین بیوراکتورهای کوچک جلوگیری می‌کند.

چندین روش برای تقسیم نمونه‌ها توسعه یافته است، از جمله فرمت‌های میکرووِل، چیپ ‌های میکروفلوئیدیک و قطره‌ای. میکروفلوئیدیک می‌تواند میلیون‌ها بیوراکتور کوچک را به شیوه‌ای ‌کارآمد ایجاد کند. دیجیتال PCR مبتنی بر قطره (ddPCR) نوعی از PCR دیجیتال است که از یک سیال ناسازگار (یعنی سیال پراکنده) در روغن (یعنی سیال پیوسته) برای تولید قطره‌های زیرمیکرولیتری با نرخ‌های کیلوهرتز استفاده می‌کند.

اسیدهای نوکلئیک مانند DNA ،RNA و DNA مکمل (cDNA) ممکن است به طور اتفاقی در داخل قطره‌ ها به عنوان اتاقک‌های واکنش بسته‌بندی شوند. درصد کمی از قطره ‌ها یک یا کمتر از یک نسخه از قالب DNA را دارند (بسیاری از قطره‌ها هیچ یک از DNA هدف را ندارند) و سپس در هر میکروقطره به صورت کلونی تقویت می‌شوند. پس از تقویت PCR معمولی، غلظت‌ها بر اساس نسبت بخش‌های غیرفلورسنت با توزیع پوآسون تعیین می‌شوند.

مزایا و معایب تکنیک دیجیتال PCR

همانطور که در بخش فرایند dPCR ذکر شد، محصول واکنش به چندین محفظه تقسیم می‌شود و DNA غیر اختصاصی در هر محفظه به میزان قابل توجهی کاهش می‌یابد. در نتیجه، نسبت سیگنال به نویز به دلیل DNA غیر اختصاصی دیگر کاهش می‌یابد که این امر تکثیر هدف‌ها را افزایش می‌دهد. dPCR به حساسیت بسیار بالای خود شناخته شده است و امکان کمی‌سازی دقیق را فراهم می‌کند.

در dPCR، توالی هدف تقویت شده پس از هر چرخه تکثیر، کمی‌سازی می‌شود و از پروب‌های فلورسنت برای کمی‌سازی هدف تقویت شده استفاده می‌شود. کمی‌سازی محصول تقویت شده با استفاده از رابطه بین آستانه چرخه (Ct) نمودار تقویت فلورسنس با منحنی استاندارد تولید شده توسط مواد مرجع انجام می‌شود. نمودار تکثیر ممکن است تحت تأثیر کارایی ناکافی و کیفیت پایین نمونه، وجود مواد غیر اختصاصی و خطاهای سیستماتیک قرار گیرد.

همانطور که در بالا ذکر شد در dPCR، مخلوط واکنش به هزاران محفظه توزیع می‌شود، بنابراین تأثیر مهارکننده‌ها کاهش می‌یابد. در نتیجه، dPCR کمی‌سازی دقیق‌تری را فراهم می‌کند و قابل تکرار است زیرا این کمی‌سازی وابسته به مواد مرجع نیست. محققان مختلف کارایی تشخیصی dPCR و PCR کمی را برای اندازه‌گیری miRNA‌ها مقایسه کرده‌اند و نتیجه گرفته‌اند که dPCR کمی‌سازی مطلق را ارائه می‌دهد.

از آنجا که توالی نوکلئوتید در هر چرخه PCR تکثیر می‌شود و شدت فلورسنس پس از یک چرخه دو برابر می‌شود، qPCR معمولاً تفاوت دو برابری در تعداد کپی‌ها را در یک آزمایش تکی حل می‌کند. کمی‌سازی مخلوط واکنش PCR در dPCR امکان تشخیص تفاوت‌ها در یک مولکول هدف را فراهم می‌کند و افزایش تعداد محفظه‌ها به نوبه خود کارایی سیستم را بهبود می‌بخشد. dPCR می‌تواند حجم کمی از یک هدف را در حضور تعداد بالایی از توالی های غیر اختصاصی‌ها را تشخیص دهد زیرا تقسیم اتاقک واکنش و تقویت نقطه پایانی نمونه کمتر در معرض مواد واکنشی غیر اختصاصی است. همچنین DNA غیر اختصاصی را به میلیون‌ها محفظه مختلف توزیع می‌کند که تأثیر مهارکننده‌ها را کاهش می‌دهد.

dPCR عملکرد تشخیصی بهتری نسبت به qPCR دارد. علاوه بر این، در dPCR، اگر مهارکننده‌ها ممکن است بر محصول PCR تأثیر بگذارند، سیگنال تقویت همچنان به درستی شناسایی می‌شود زیرا شدت سیگنال فلورسنس آن‌ها چندین برابر بیشتر از سیگنال‌های پس‌زمینه است. برخی ویژگی‌های qPCR نسبت به dPCR از اهمیت قابل توجهی برخوردار هستند. هنگام کمی‌سازی RNA نیز مشکل بیشتر می شود زیرا فرآیند تبدیل معکوس برای تمام RNA هدف اتفاق نمی‌افتد  و نه تمام نسخه‌های RNA اندازه‌گیری می‌شوند. بیشتر دستگاه‌های dPCR دو رنگ مختلف فلورسنت را اندازه‌گیری می‌کنند در حالی که دستگاه‌های qPCR قادر به اندازه‌گیری سیگنال‌های فلورسنت از چهار تا شش رنگ مختلف متصل به هدف‌های مختلف هستند.

بیشتر بخوانید:تکنیک مولکولی FISH

شناسایی سرطان توسط تکنیک dPCR

در سال 2010، برای اولین بار از dPCR برای کمی‌سازی سرطان پستان استفاده شد. سرطان، شایع‌ترین تومور بدخیم، علت اصلی مرگ و میر ناشی از سرطان در سراسر جهان است. محققان مختلف در تلاش برای توسعه استراتژی‌هایی برای تشخیص زودهنگام بیماری و بهبود نتایج درمان هستند. بیوپسی دقیق همچنان برای تشخیص انواع مختلف تومورها مهم است. انواع مختلفی از اسیدهای نوکلئیک در مایعات بدن وجود دارند، از جمله DNA آزاد سلولی (cfDNA) و DNA توموری گردش کننده (ctDNA).

cfDNA مهم‌ترین بیومارکر برای تشخیص بیومارکرهای غیرتهاجمی در تشخیص سرطان است. اگرچه  cfDNA  در مایعات مختلف بدن وجود دارد، به عنوان مثال، خون، پلاسما، ادرار، مایع پلور، مایع مغزی‌نخاعی و بزاق، که برای توصیف cfDNA و ctDNA (زیر مجموعه cfDNA است که از سلوهای سرطانی و بافت های توموری به درون جریان خون ترشح می شود) بیشتر استفاده می‌شوند. cfDNA قطعه کوتاه تک و دو رشته DNA با طول تقریبی <200 جفت باز (bp) است. هر دو سلول سالم و توموری cfDNA را در گردش خون آزاد می‌کنند. در افراد سالم، cfDNA معمولاً پس از آپوپتوز سلول‌ها از سلول‌های خون‌ساز آزاد می‌شود.

در محیط‌های سالم، غلظت‌های cfDNA در محدوده 10-1 نانوگرم بر میلی‌لیتر است که بسیار پایین بوده و می‌تواند در کمتر از 2.5 ساعت پاکسازی شود و اکثر پاکسازی‌ها در کبد اتفاق می‌افتد. در سلول‌های سرطانی، شدت افزایش آزادسازی متابولیت‌های مختلف مانند اسیدهای نوکلئیک، پروتئین‌ها و وزیکول‌های خارج سلولی در گردش خون وجود دارد. به دنبال افزایش گردش سلول‌ها در سلول‌های سرطانی، بیماران مبتلا به سرطان معمولاً سطح بالاتری از cfDNA دارند. در چندین بافت توموری جامد، ctDNA یافت شده است که سطح آن از 0.1٪ تا حدود 50٪ متغیر است. به عنوان یک بیومارکر برای تشخیص و پیش‌آگاهی سرطان شناخته شده است و ارزش بالینی ctDNA در انکولوژی در سال‌های اخیر به سرعت افزایش یافته است.

برای تشخیص متاستاز و تغییر درمان، Olsson و همکارانش در سال 2015، ترکیب WGS (توالی‌یابی ژنوم کامل) با ddPCR PCR دیجیتال مبتنی بر قطره را برای کمی‌سازی تغییرات خاص تومور انجام دادند و نشان دادند که ctDNA مهم‌ترین بیومارکر برای تشخیص غیرتهاجمی سرطان است. علاوه بر این، نظارت بر ctDNA مهم‌ترین بیومارکر برای تمایز بیماران پس از جراحی با عود از کسانی است که عود نداشته‌اند. تقریباً 86٪ از بیمارانی که دارای جهش‌های قابل تشخیص بودند، علائم بالینی نشان دادند، در حالی که بیمارانی که پس از عمل جراحی ctDNA قابل تشخیصی نداشتند، نرخ بقای طولانی‌تری داشتند. سطح بالاتر ctDNA نشان‌دهنده متاستاز است.

ctDNA از سلول‌های نکروتیک و آپوپتوتیک و همچنین از سلول‌های تومور گردشی آزاد می‌شود. مطالعات مختلف  در این راستا برای تشخیص انواع مختلف لوسمی و تومورها استفاده شده است. در بسیاری از موارد، dPCR  برای تکمیل توالی‌یابی نسل بعدی استفاده می‌شود. سرطان پستان نیز شایع‌ترین تومور بدخیم است که زنان را در سراسر جهان تحت تأثیر قرار می‌دهد. ctDNA مهم‌ترین بیومارکر در سرم است و پیش‌آگاهی سرطان پستان نیز بسیار بالا است. نظارت مداوم بر ctDNA می‌تواند به عنوان یک آزمایش غربالگری عمل کند و به عنوان یک آزمایش شناسایی برای افرادی که در معرض خطر بالاتری هستند، عمل کند.         

dPCR می تواند نتایج NGS را دوباره آزمایش کند.

با توجه به اینکه کارایی تکثیر توسط عوامل مختلفی مانند آنزیم‌ها، پرایمرها و مهارکننده‌ها تعیین می‌شود، سیکل آستانه (Ct)، که یک مقدار ضروری برای تحلیل کمی است، در PCR سنتی traditional  ناپایدار است؛ در نتیجه، آزمایش‌هایی با طراحی یکسان ممکن است دارای تکرارپذیری ضعیف یا حتی نتایج متناقض باشند. بر خلاف PCR کمی فلوروژنیک، dPCR میزان بیان اسیدهای نوکلئیک را با سیگنال‌های نقطه پایانی، به جای مقادیر Ct، محاسبه می‌کند؛ بنابراین، نتایج آن اختلالات ناشی از تکثیر ناپایدار را حذف کرده و دارای تکرارپذیری بسیار بالایی با نرخ خطای کمتر از 5٪ می‌شود.

در dPCR، تعداد پرایمرها و پروب‌ها کاهش می‌یابد، که این امر موجب کاهش اتصال نادرست توالی‌های هدف می‌شود. dPCR می‌تواند با NGS ترکیب شود تا داده‌ها را کمی‌سازی و تفسیر کند. از یک طرف،dPCR  می‌تواند نتایج NGS را دوباره آزمایش کند. از طرف دیگر، کیفیت داده‌های توالی‌یابی، از جمله آداپتورها، دایمر مشترک، پیوند خطای اتصال error link fragment و جانکشن‌های ادغام طولانی long fusion junctions تضمین می‌شود. در کل، dPCR تکنیک‌های قبلی را در تمام جنبه‌ها پشت سر می‌گذارد.

کلام آخر

در این مقاله شما با تکنیک Digital PCR، فرایند، چگونگی کارکرد و همچنین نحوه شناسایی سرطان توسط این تکنیک آشنا شدید. این فناوری به دلیل دقت بسیار بالا برای اندازه‌گیری غلظت مطلق مولکول‌های DNA یا RNA  به دلیل تقسیم شدن نمونه ها به هزاران قطره با اندازه نانولیتر و کاربردهای متنوع از جمله تشخیص جهش‌های نادر، نظارت بر بیماری باقیمانده حداقلی و کمیت‌سنجی جهش‌ها در تحقیقات سرطان حائز اهمیت می باشد و لذا، امروزه این تکنیک در آزمایشگاه ها و مراکز تحقیقاتی در حال راه اندازی و اجرا است و در این راستا، نیاز به دستگاه های Digital PCR وجود دارد. جهت دریافت مشاوره تخصصی در راستای راه اندازی بخش مولکولی و خرید دستگاه PCR با کارشناسان ما در مجموعه ماناتک تماس حاصل فرمایید.