MLPA معرفی
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) یک تکنیک مولکولی است که برای تشخیص تغییرات تعداد کپی‌های DNA (CNVs) به کار می‌رود. این روش به خصوص برای شناسایی دوبرابر شدن‌ها یا حذف‌های توالی‌های DNA که برای تشخیص اختلالات ژنتیکی، برخی سرطان‌ها و ناهنجاری‌های کروموزومی بسیار مهم هستند، بسیار مفید است. در ادامه به تشریح جنبه‌های کلیدی آن می‌پردازیم:
اصول
- پروبهای هدف‌مند: MLPA از مجموعه‌ای از پروبها استفاده میکند که به توالی‌های خاصی از DNA علاقه‌مند هستند. هر پروب از دو نیمه تشکیل شده است که میتوانند به طور مجاور به توالی هدف DNA بچسبند.
- لیگاسیون و تکثیر: پس از هیبرید شدن پروبها به DNA هدف، اگر به درستی روی رشته DNA قرار گرفته باشند، به هم متصل (لیگاته) میشوند. این رویداد لیگاسیون بسیار مهم است زیرا فقط پروبهای لیگاته در مراحل بعدی تکثیر میشوند.
- قابلیت چندگانگی: MLPA می‌تواند چندین توالی DNA را به طور همزمان در یک واکنش تحلیل کند، که این امر آن را به یک تکنیک بسیار کارآمد برای غربالگری در مقیاس بزرگ تبدیل میکند.
کاربردها
- اختلالات ژنتیکی: MLPA به طور گسترده‌ای در تشخیص بالینی برای تشخیص بیماری‌های ژنتیکی مانند دیستروفی عضلانی دوشن یا برخی سرطان‌های ارثی به کار می‌رود.
- تحلیل تغییرات تعداد کپی: این روش در شناسایی تغییرات در تعداد کپی‌های ژن‌های خاص بسیار مؤثر است که برای درک و تشخیص انواع مختلف شرایط ژنتیکی حیاتی است.
- تشخیص‌های پیش از تولد و سرطان: در تست‌های پیش از تولد برای شناسایی ناهنجاری‌های کروموزومی و در شناسایی تغییرات ژنتیکی خاصی که با انواع مختلف سرطان‌ها مرتبط هستند کمک میکند.
مزایا
- حساسیت و اختصاصیت: MLPA بسیار حساس است و حتی تغییرات تک‌کپی در تعداد ژنها را تشخیص می‌دهد.
- کارآمد برای تعداد زیادی از نمونه‌ها: این روش برای غربالگری با توان بالا مناسب است و امکان پردازش همزمان بسیاری از نمونه‌ها را فراهم میکند.
- صرفه‌جویی در هزینه: در مقایسه با برخی روش‌های دیگر مانند آرایه CGH، MLPA برای تست تعداد محدودی از لوکوس‌های ژنتیکی از نظر هزینه مؤثرتر است.
محدودیت‌ها
- محدود شده توسط طراحی پروب: دامنه تغییرات ژنتیکی قابل تشخیص به نواحی‌ای که برای آنها پروبها طراحی شده‌اند محدود است.
- محدودیت تجزیه و تحلیل کمی: در حالی که MLPA برای تشخیص وجود یا عدم وجود تغییرات تعداد کپی عالی است، در تعیین دقیق تعداد کپی‌ها کمتر دقیق است.
- نیاز به تجهیزات تخصصی: این تکنیک نیاز به تجهیزات تخصصی برای الکتروفورز کاپیلاری و پرسنل ماهر برای تفسیر دقیق نتایج دارد
مراحل و زمان بندی روش MLPA
توجه داشته باشید که این زمانها میتوانند بر اساس کیتهای خاص MLPA و دستورالعملهای تولیدکننده کمی متفاوت باشند.
- استخراج DNA
مدت زمان: 30 دقیقه تا چند ساعت
– توضیح: DNA از نمونه های بیولوژیکی استخراج میشود. زمان لازم برای این مرحله به روش استخراج و نوع نمونه بستگی دارد.
- دناتوراسیون DNA
– مدت زمان: 5 دقیقه
– توضیح: DNA استخراج شده در دمای بالا (معمولاً حدود 95 درجه سلسیوس) قرار داده میشود تا دو رشته آن از هم جدا شوند.
- هیبریداسیون پروب
– مدت زمان: 16-20 ساعت (معمولاً شبانه)
– توضیح: پروبهای MLPA به رشتههای تکی DNA در دمای پایینتر (حدود 60 درجه سلسیوس) هیبرید میشوند. این مرحله معمولاً شبانه انجام میشود تا زمان کافی برای هیبریداسیون فراهم شود.
- لیگاسیون
– مدت زمان: 15 دقیقه تا 1 ساعت
توضیح: پروب های هیبرید شده توسط آنزیم لیگاز به یکدیگر متصل میشوند. این مرحله در دمای کمتر (حدود 54 درجه سلسیوس) انجام میشود.
- PCR
– مدت زمان: 2-3 ساعت
– توضیح: پروب های لیگه شده توسط PCR تکثیر میشوند. این مرحله شامل چندین چرخه حرارتی است که شامل دناتوراسیون، هیبریداسیون پرایمر و اکستنشن است.
- تجزیه و تحلیل
– مدت زمان: 1-2 ساعت
بیشتر بخوانید:دستگاه دیجیتال pcr
– توضیح: محصولات PCR توسط روشهایی مانند الکتروفورز ژل یا سکوئنسینگ مورد تجزیه و تحلیل قرار میگیرند. این مرحله به تشخیص وجود یا عدم وجود تغییرات در تعداد کپی های ژنها کمک میکند.
برای انجام تست MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)، چندین دستگاه و ابزار آزمایشگاهی کلیدی نیاز است. در اینجا به برخی از مناسب ترین و متداول ترین دستگاههای مورد استفاده برای هر مرحله اشاره میکنم:
- دستگاه استخراج DNA
– کاربرد: استخراج DNA از نمونه های بیولوژیکی.
– دستگاه های رایج: دستگاه هایی مانند QIAcube (QIAGEN) یا KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) که امکان استخراج خودکار DNA را فراهم میکنند.
– کاربرد: انجام PCR و چرخههای حرارتی برای دناتوراسیون DNA و لیگاسیون پروبها.
– دستگاههای رایج: ترموسایکلرهایی مانند (Applied Biosystems) veriti یا C1000 Touch (Bio-Rad) که دقت حرارتی بالایی دارند و برنامه ریزی چرخه های حرارتی مختلف را امکانپذیر میکنند.
- دستگاه الکتروفورز
– کاربرد: جداسازی و تجزیه و تحلیل محصولات PCR.
– دستگاه های رایج: دستگاههای الکتروفورز ژل مانند Gel Doc (Bio-Rad) یا systems from Invitrogen که امکان تجزیه و تحلیل دقیق نمونه ها را فراهم میکنند.
- دستگاه کپیلاری الکتروفورز یا سکوئنسر
– کاربرد: تجزیه و تحلیل دقیقتر محصولات PCR برای شناسایی تغییرات در تعداد کپی های ژن ها.
– دستگاه های رایج: دستگاه هایی مانند ABI Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) یا QIAxcel (QIAGEN) که امکان تجزیه و تحلیل دقیقتری را نسبت به الکتروفورز ژل ساده فراهم میکنند.
در اینجا به بررسی الزامات و ویژگی‌های دستگاههای PCR مناسب برای MLPA می‌پردازیم:
الزامات کلیدی برای دستگاههای PCR در MLPA
- توانایی‌های سیکلر حرارتی: تجهیزات اصلی مورد نیاز برای MLPA یک سیکلر حرارتی است که یک دستگاه استاندارد در آزمایشگاه‌های بیولوژی مولکولی است. این دستگاه باید قادر به کنترل دقیق چرخههای دمایی مورد نیاز برای PCR باشد.
- پروفایل‌های دمایی قابل برنامه‌ریزی: سیکلر حرارتی باید امکان برنامه‌ریزی پروفایل‌های دمایی خاص را فراهم کند. مراحل مختلف MLPA مانند دناتوره شدن، آنیلینگ و اکستنشن، به دماهای مختلفی نیاز دارند و دستگاه باید قادر به تغییر دقیق و سریع بین این دماها باشد.
- توزیع یکنواخت دما: حفظ دمای یکنواخت در تمامی چاهک های نمونه برای دستگاه PCR ضروری است تا اطمینان حاصل شود که تکثیر در تمام نمونه‌ها به طور یکسان انجام میشود.
- ظرفیت نمونه: دستگاه باید قادر به جای دادن تعداد نمونه‌هایی باشد که برنامه‌ریزی کرده‌اید. سیکلرهای حرارتی با ظرفیت‌های متفاوتی وجود دارند، از چند تا چند صد چاه.
- سازگاری با حجم واکنش‌ها: واکنش‌های MLPA ممکن است به حجم‌های خاصی نیاز داشته باشند و سیکلر حرارتی باید با این تنظیمات واکنش، که معمولاً شامل حجم‌های کوچک است، سازگار باشد.
الزامات پس از PCR
- به یاد داشته باشید، MLPA همچنین نیاز به تجزیه و تحلیل پس از PCR دارد که معمولاً شامل الکتروفورز مویرگی است. این مرحله برای تجزیه و تحلیل محصولات تقویت شده بسیار مهم است و معمولاً با استفاده از تجهیزات تخصصی، اغلب جدا از دستگاه PCR انجام می شود.
کلام آخر
به طور خلاصه، در حالی که MLPA الزامات خاصی برای هیبریداسیون و بستن پروب دارد، مرحله PCR را می توان با استفاده از چرخه های حرارتی استاندارد موجود در اکثر آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی انجام داد، مشروط بر اینکه معیارهای کنترل دما و قابلیت برنامه ریزی چرخه را داشته باشند. چندین تولید کننده تجهیزات مولکولی از جمله PCR وجود دارد که از جمله آنها می توان به کمپانی های بزرگ و معتبر Thermo Fisher Scientific، Bio-Rad و Eppendorf اشاره کرد. مدل ها از نظر ظرفیت، دقت و ویژگی های اضافی متفاوت هستند. برای MLPA، یک سیکلر حرارتی استاندارد از هر سازنده معتبر کافی است، تا زمانی که الزامات اساسی ذکر شده در بالا را برآورده کند.
برای اطلاعات بیشتر میتوانید با کارشناسان ما در شرکت ماناتک در تماس باشید.
