استخراج DNA از باکتری

تاریخچه استخراج DNA در باکتری ها

برای اولین بار استخراج DNA در  باکتریها در سال ۱۹۱۹ توسط دانشمندان فرانسوی به نام های Frédéric Bordet و Octave Gengou انجام شد. آنها با استفاده از یک روش ساده که شامل لیز سلولی با حرارت و تصفیه با الکل بود، DNA را از باکتری Bordetella pertussis جداسازی کردند. این باکتری عامل بیماری سیاه سرفه است. آنها نشان دادند که DNA باکتریایی میتواند به عنوان یک آنتی ژن عمل کند و پاسخ ایمنی را در موشها القا کند.

برای اولین بار استخراج DNA باکتری از خون در سال ۱۹۴۴ توسط دانشمندان آمریکایی به نام های Oswald Avery، Colin MacLeod و Maclyn McCarty انجام شد. آنها با استفاده از یک روش که شامل لیز سلولی با حرارت و تصفیه با فنل و کلروفرم بود، DNA را از باکتری Streptococcus pneumoniae جداسازی کردند. این باکتری عامل بیماری التهاب ریه است. آنها نشان دادند که DNA باکتریایی میتواند به عنوان یک عامل وراثت عمل کند و خصوصیات زیستی را به باکتریهای دیگر منتقل کند.

استخراج DNA از باکتری ها

استخراج DNA از باکتری ها، یکی از فرایندهای مهم در زیست شناسی مولکولی است که برای شناسایی، طبقه بندی، کلونینگ و تعیین توالی ژنهای باکتریایی استفاده میشود. استخراجDNA  (که برای فرایند PCR انجام می شود)، در باکتری ها به 2 روش دستی و با کمک کیت (ستونی) میتواند انجام شود. در روش دستی (جوشاندن یا boiling) که روشی ساده و کم هزینه می باشد، برای استخراج DNA در باکتری های گرم منفی از جمله E.coli  استفاده می شود، (بدلیل وجود تعداد لایه کم در دیواره این باکتری ها) ولی معمولا استخراج DNA  باکتری های گرم مثبت به دلیل وجود 40-30 لایه پپتیدوگلیکان در دیواره سلولی با انواع کیت های استخراج با روش ستونی امکان پذیرتر می باشد.

روش جوشاندن استخراج DNA

مواد و وسایل موردنیاز:

• سمپلر و سر سمپلر
• میکروتیوب 5/1
• شیکر
• سانتریفیوژ
• انکوباتور 37 درجه
• بن ماری 100 درجه سانتی‌گراد
• نانو دراپ
• آب مقطر استریل

مراحل استخراج DNA برای انجام تکنیک PCR  با استفاده از روش boiling به شرح ذیل انجام گرفت:

بیشتر بخوانید:استخراج DNA آزاد سلولی

1. برای استخراج DNA به روش boiling بهتر است که از کلنی حاصل از کشت تازه (24 ساعته) استفاده شود و کشت معمولا بر روی محیط مک کانکی آگار صورت می پذیرد، بعد از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‌گراد استخراج سویه‌های مورد نظر بطریق زیر انجام میگیرد:
2. ابتدا 3 تا 5کلنی پر از هر نمونه را در داخل میکروتیوب ml5/1 حاوی λ200 آب مقطراستریل حل میکنیم.
3. با استفاده از شیکر نمونه ها را shake کرده تا این که کاملا حل شوند.
4. ویال‌ها را به مدت 10 تا 15 دقیقه، داخل بن‌ماری جوش(C˚100) قرار دادیم به‌طوری‌که سطح آب جوش دو سوم ویال را در بر‌گیرد. (هدف از جوشاندن، لیز دیواره سلول های باکتریایی و آزاد شدن محتوای ژنتیکی آنها است.)
5. سپس ویال‌ها رابه مدت 5 تا 10 دقیقه، با دور g13000 سانتریفوژ میکنیم. محلول رویی(سوپرناتانت) ویال‌ها که حاوی DNA می‌باشد، به‌عنوان DNA الگو برای انجام واکنش PCRبه میکروتیوب استریل منتقل شدند.
6. در مرحله پس از استخراج، برای اطمینان از وجود DNAتوتال، از دستگاه نانودراپ در دو طول موج 280 و 260 نانومتر استفاده می شود.

روش ستونی

روش ستونی یکی از روشهای مبتنی بر فاز جامد است که برای خالص سازی DNA از نمونه های باکتریایی استفاده میشود. این روش بر اساس تمایل جذب DNA به یک ماده جامد مانند سیلیکا در شرایط خاص بسته به pH و غلظت نمکی بافر کار میکند. این روش شامل چند مرحله است:

• لیز سلول: در این مرحله، سلولهای باکتریایی که در محیط کشت رشد کرده اند، توسط عوامل فیزیکی یا شیمیایی شکسته و DNA آنها آزاد میشود. عوامل فیزیکی مانند حرارت، سرما، تشعشعات، فراصوت و غیره و عوامل شیمیایی مانند لیزوزوم، پروتئیناز K، SDS و غیره مورد استفاده قرار میگیرند.
• جذب DNA: در این مرحله، DNA را به یک ستون حاوی گرانول های سیلیکایی اضافه میکنند. بافر مناسب را به ستون اضافه میکنند تا DNA به گرانول های سیلیکایی بچسبد. این بافر معمولاً شامل نمک و قلیای خفیف است.
• شستشو: DNA در این مرحله، ستون را با چندین بافر شستشو تمیز میکنند تا پروتئین ها، لپیدها و سایر آلودگی های سلولی را از DNA جدا کنند. این بافرها معمولاً شامل الکل و نمک هستند.

• حذف: DNA در این مرحله، DNA را از ستون با استفاده از گرادین فشار جدا کرده و در یک بافر مناسب حل کرده و آماده برای استفاده در آزمایشات بعدی مانند PCR و تعيين توالي مي كنند. اين بافر معمولاً شامل آب يا بافر TE است.

برای ساده سازی و سرعت بخشیدن به فرآیند استخراج DNA از باکتري، بسياري از كمپاني هاي تجاري كيت هاي خاص را برای این منظور عرضه مي كنند. اين كيت ها شامل بافر ها و راهبردهای مناسب برای جذب و حذف DNA هستند.

کیت های استخراج DNA از باکتری شرکت ماناتک:

این کیت، برای استخراج DNA از باکتری های گرم منفی و گرم مثبت می باشد ولی در برخی موارد ممکن است روش های فنول کلروفرم یا جوشاندن نتیجه بهتری را برای شما فراهم کند.

• برای استخراج DNA از باکتری، باید از ۲۰۰ میکرولیتر محلول DB1 و ۲۰ میکرولیتر محلول DB2 برای هر نمونه استفاده کنید. بعد از اضافه کردن محلول DB2، باید نمونه را ۵ دقیقه در حالت بن ماری قرار دهید تا DNA کاملا آزاد شود.
• بعد از آن، باید نمونه را ۱۰ دقیقه در دمای -۲۰ درجه سانتیگراد قرار دهید تا پروتئین ها و آلودگی های دیگر ته نشین شوند. سپس باید نمونه را ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار دهید تا DNA به حالت جامد درآید.
• سپس باید نمونه را با استفاده از یک سرنگ سانتریفیوژ کنید و فاز مایع را به یک لوله جدید منتقل کنید. به این لوله جدید ۶۰۰ میکرولیتر محلول DB3 اضافه کنید و خوب تکان دهید. سپس لوله را به ستون سیلیکا ژل وصل کنید و با استفاده از یک سرنگ، محلول را از ستون عبور دهید. این کار باعث میشود که DNA به سطح ستون بچسبد.
• بعد از آن، باید ستون را با ۵۰۰ میکرولیتر محلول DB3 شستشو دهید تا آلودگیهای باقیمانده را حذف کنید. سپس ستون را با ۵۰۰ میکرولیتر الکل ۷۰ درصد شستشو دهید تا DNA را خشک کنید.
• در نهایت، باید DNA را با ۵۰ تا ۱۰۰ میکرولیتر محلول DB4 آزادسازی و بازیابی کنید. برای این کار، باید محلول DB4 را به ستون اضافه کنید و ۵ دقیقه صبر کنید تا DNA به حالت مایع درآید. سپس با استفاده از یک سرنگ، محلول را از ستون عبور دهید و در یک لوله جدید جمع آوری کنید.

کلام آخر

شما میتوانید برای خرید محصول مناسب با پروژه خودتان پس از مطالعه متن بالا با کارشناسان حرفه ای ما مشورت کنید. شرکت ماناتک انواع کیت های استخراج ستونی و مگنتی را برای سهولت و تسریع  در  کار شما با قیمت مناسب و کیفیت بالا در اختیار شما میگذارد.