رنگ ها در تکنیک Real Time PCR به دو گروه اختصاصی (پروب) و غیر اختصاصی ( نشانگر فلورسنت) تقسیم می شوند که به این نشانگرهای غیر اختصاصی، intercalating dye نیز گفته می شود.
معرفی اواگرین و سایبرگرین
اواگرین، فلوروفوری است که در نور ماورای بنفش تابیده می‌شود و نور قرمز فلورسانس تولید میکند.مقاومت شیمیایی بالای این فلوروفور استفاده از آن را در شرایط سخت آزمایشگاهی مقرون به صرفه میکند.این فلوروفور در تکنیک هایی مانند میکرواری، فلوسایتومتری، ایمونوفلوئورسانس هم دارای کاربرد می باشد.
این ماده یک رنگ یا فلوروفور سبز است که به میزان کمتری نسبت به رنگ‌های دیگر واکنش PCR را مهار میکند و برای تکنیک های کاربردی مانند RT-PCR بسیار مفید است. همچنین، اگر از ژل‌هایی با نقطه ذوب کم برای بهبود DNA استفاده شود، انتخاب خوبی است، همچنین دارای ضریب تبدیل فوتون بالا و قدرت تفکیک فضایی و طول موج خوبی می باشد.
اوا گرین در دماهای بالا بسیار پایدار و با ثبات است و به خودی خود دارای فلورسانس بسیار کمی است، اما هنگام اتصال به DNA به صورت طولانی مدت فلورسانس تولید میکند . همچنین، مشخص شده است که این رنگ از نظر سمیت سلولی یا جهش‌زایی، بسیار کم یا فاقد آن است که نشان دهنده این است که اوا گرین به عنوان یک رنگ فلورسنت برای بررسی و اندازه‌گیری DNA در تحقیقات بیولوژیکی و پزشکی از اهمیت بالایی برخوردار است.
وقتی که DNAدر محیط وجود ندارد و سایبرگرین آزاد است رنگ از خودش هیچ سیگنال فلورسنتی ساطع نمی کند ولی به محض زیاد شدن DNAدو رشته ای در محیط، سایبرگرین به DNAدو رشته ای می چسبد و از خودش سیگنال فلورسنت ساطع میکند، سایبرگرین میتواند به DNA تک رشته ای هم بچسبد ولی در دو رشته DNA میزان اتصال 10 برابر بیشتر است.
اواگرین و سایبرگرین، هر دو شناساگر غیر اختصاصی در تکنیک ریل تایم PCR می باشند که برای مشاهده مرحله به مرحله میزان تکثیر محصول PCR( ژن مورد نظر شما) استفاده می شوند و به گره های کوچک minor grooves در DNA دو رشته ای متصل می شوند (interclator) و با آن واکنش می دهند و لازم به ذکر است که اواگرین توانایی اتصال به DNA تک رشته ای را ندارد.
نکات
- سایبرگرین در طول موج 497 برانگیخته می شود و در طول موج 520 نور ساطع میکند.
- سایبرگرین مشهورتر و اواگرین کمیاب تر است.
مقایسه اواگرین و سایبرگرین:
از نظر طیفی: اواگرین شبیه به FAM یا SYBR Green است یعنی زمانی که از مستر میکس حاوی اوا گرین استفاده می کنیم، هیچ تغییری در تنظیمات نوری لازم نیست انجام گیرد.
- پایداری: اواگرین پایداری بسیار بیشتری نسبت به سایبرگرین دارد و به دنبال چرخه های متعدد انجماد و ذوب، مقاومت بیشتری در برابر تخریب از خود نشان می دهد و فلورسانس طولانی‌تری تولید میکند.
- پهنای طیف فلورسانس: پهنای طیف فلورسانس سایبرگرین باریک‌تر است که باعث بهبود قدرت تفکیک می‌شود. در حالی که اواگرین پهنای طیف وسیع‌تری دارد.
- میزان فلورسانس: میزان فلورسانس سایبرگرین بیشتر از اواگرین است و به همین دلیل حساسیت بیشتری دارد.
استفاده: سایبرگرین مناسب آزمایش‌هایی است که نیاز به حساسیت و تفکیک بالا دارند. درحالی‌که اواگرین برای آزمایش‌هایی که مقاومت و پایداری لازم است مناسب‌تر است.
سازگاری با محیط: با محیط زیست سازگاری دارد و ایمن تر است.
میزان مهار: مهار PCR بسیار کمتری نسبت به سایبر گرین دارد.
از اتصال پرایمر های غیر اختصاصی و ایجاد دایمر پرایمر در دمای انلینگ جلوگیری می کند.
معایب سایبرگرین
در کنار مزایا و داده های خیلی خوبی که حاصل میکند ممکن است گاهی از واکنش PCR ممانعت کند و ترجیحا به سکانس های GC reach متصل می شود.
قیمت اواگرین و سایبرگرین
قیمت ها متفاوت است ولی به‌طور کلی، اواگرین گران‌تر از سایبرگرین است.
- اواگرین: این محصول به دلیل پایداری بالاتر قیمت بسیار گران‌تری دارد و در حدود 50-15 دلار برای هر میلی‌لیتر تخمین زده می‌شود.
به‌طور کلی اواگرین و سایبرگرین بر اساس ویژگی‌های متفاوتی طراحی شده‌اند و بهتر است با توجه به نوع نمونه و بافت، مبلغ بودجه و میزان تخصص کارشناس نوع رنگ های فلورسنت انتخاب می شود ، هر کدام را انتخاب کنیم.
