استخراج total RNA

روش های استخراج total RNA

استخراج RNA

فرایندی است که طی آن RNA کل موجود در یک نمونه هموژنیزه شده، سلولی جدا و تصفیه میشود. این روش آزمایشگاهی در بیوتکنولوژی ، مهندسی ژنتیک و دیگر علوم زیستی کاربرد ویژه ای دارد و یکی از پیشنیازهای ضروری در فرآیندهایی همچون  تست پی سی آر PCR و RT-PCR ، نورترن بلاتینگ و دیگر روشها میباشد.

انواع RNA ی که میتوان از نمونه های سلولی استخراج کرد عبارتند از:

• RNA کل:( Total RNA) شامل تمام انواع RNA موجود در سلول هستند، از جمله mRNA، rRNA، tRNA، miRNA و دیگر RNAهای غیرکد کننده.
• RNA پلی آ Poly A RNA)): شامل mRNAهای دارای پلی آدنیلات هستند که برای بیان ژنهای پروکاریوتی و یوکاریوتی مسئول هستند.
• RNA کوچک ( Small RNA): شامل RNAهای غیرکد کننده با طول کمتر از ۲۰۰ نوکلئوتید هستند که نقش مهمی در تنظیم بیان ژنها، اپی ژنتیک و دفاع ضد ویروس دارند. مثالهایی از این گروه miRNA، siRNA، piRNA و snoRNA هستند.
• RNA ویرال (Viral RNA): شامل RNAهای ژنوم ویرال هستند که برای تشخیص، شناسایی و تعیین عفونت ویرال مورد استفاده قرار میگیرند.

کاربردهای استخراج RNA عبارتند از:

• بررسی بیان ژنها در سطح mRNA با استفاده از روشهای RT-PCR، qRT-PCR، نورترن بلاتینگ، cDNA لایبرری سازي و ترانسکریپتوم.
• بررسی تغییرات پس از ترانسکریپشن Post-transcriptional modifications) ) مانند اسپلایسینگ، تغییرات شیمیایی و ساختاری در RNA با استفاده از روشهای RACE، SAGE، RLM-RACE و SHAPE.
• بررسی تعاملات RNA-RNA یا RNA- پروتئین با استفاده از روشهای CLIP، RIP، SELEX و HITS-CLIP.
• بررسی تاثیر RNAهای غیرکد کننده بر تنظيم بيان ژنها، پاسخ به استرس و دفاع ضد ويروس با استفاده از روشهای miRNA array، miRNA-seq، siRNA knockdown و CRISPRi.
• بررسی عفونت ویرال و تعیین ژنوتیپ و فنوتیپ ویرال با استفاده از روشهای RT-PCR، qRT-PCR، RFLP، RAPD و سکانسینگ.

برای استخراج RNA با کیفیت و خلوص بالا، روشهای مختلفی وجود دارد که بسته به نوع نمونه، نوع RNA مورد نظر و هدف آزمایش انتخاب میشوند.

سه تکنیک رایج و متداول برای استخراج RNA

• روش استخراج بر اساس کلروفرم-فنل:

این روش یک تکنیک استخراج مایع-مایع است که با استفاده از ترکیبات شامل فنل، کلروفرم وGITC ، RNA را از DNA، پروتئینها و دیگر ترکیبات سلولی جداسازي مي كند. در این روش، نمونه بافت یا سلول همگن سازي شده و سپس با فنل و کلروفرم مخلوط مي شود. این باعث مي شود که فازهای مختلف تشکيل شود که در آن RNA به فاز آبي منتقل شده و DNA و پروتئینها در فاز عضوي باقي مي مانند. سپس RNA را با الکل رسوب داده و شستشو داده و حلال سازي مي كنيم.

• روش استخراج به روش ستون چرخشي مبتني بر غشاء سيليكا:

این روش یک تکنیک استخراج جامد-مایع است که با استفاده از ستونهای دارای غشاء سيليكا، RNA را از DNA، پروتئینها و دیگر ترکیبات سلولی جداسازي مي كند. در این روش، نمونه بافت یا سلول همگن سازي شده و سپس به ستون حاوي غشاء سيليكا اضافه مي شود. RNA به غشاء سيليكا قطب شده و در حالي که DNA و پروتئینها از ستون عبور مي کنند، در آن باقي مي ماند. سپس RNA را با استفاده از بافر شستشو پاكسازي کرده و با بافر حلال سازي از غشاء جداسازي مي كنيم.

• روش استخراج با استفاده از ذرات مغناطيس:

این روش یک تکنیک استخراج جامد-مایع است که با استفاده از ذرات مغناطيسي دارای پوشش خاص، RNA را از DNA، پروتئینها و دیگر ترکیبات سلولی جداسازي مي كند. در این روش، نمونه بافت یا سلول همگن سازي شده و سپس به ذرات مغناطيسي اضافه مي شود. RNA به ذرات مغناطيسي قطب شده و در حالي که DNA و پروتئینها در محلول باقي مي مانند، به کمک یک المنت مغناطيسي از محلول جداسازي مي شود. سپس RNA را با استفاده از بافر شستشو پاكسازي کرده و با بافر حلال سازي از ذرات جداسازي مي كنيم.

این سه روش هر کدام مزایا و معایب خود را دارند که باید بر اساس نیاز و شرایط آزمایش تعیین شوند. برخی از عواملی که در انتخاب روش مناسب تاثیر دارند عبارتند از: نوع و مقدار نمونه، نوع و خلوص RNA مورد نظر، هزینه و زمان آزمایش، حساسیت و دقت آزمایش، تجهیزات و تجربه آزمایشگاهی و هدف نهایی آزمایش.

بیشتر بخوانید:استخراج DNA آزاد سلولی

بسته به منبع نمونه، نوع RNA مورد نظر و هدف آزمایش، روش های مختلفی برای استخراج RNA وجود دارد که معمولا شامل مراحل زیر هستند:

• برداشت بافت: در این مرحله بافت مورد نظر از سلولها یا ارگانهای زنده جدا شده و به صورت تازه یا فریز شده نگهداری میشود.
• همگن سازی: در این مرحله بافت را با استفاده از روشهای فیزیکی یا شیمیایی خرد کرده و سلول ها را لیز کرده تا RNA و دیگر مولکول های سلولی آزاد شوند.
• جداسازی فازها: در این مرحله RNA را از DNA، پروتئینها و دیگر ترکیبات سلولی جدا کرده و به فاز مخصوص خود منتقل میکنند. برای این منظور معمولا از ترکیبات شامل فنول، کلروفرم، ترایزول استفاده میشود.
• رسوب سازی RNA : یک روش مهم و پرکاربرد در زیست شناسی مولکولی است که به شما امکان می دهد RNA را با خلوص بالا و بدون آلودگی DNA یا پروتئین استخراج کنید. این روش در بسیاری از کاربردهای تحقیقاتی و تشخیصی مانند RT-PCR، نورترن بلات، سنتز cDNA، هیبرید سازی in situ و غیره به کار می رود.
• شستشو: در این مرحله RNA رسوب شده را با استفاده از الکل، آب DEPC-treated و بافر TE (Tris-EDTA) شستشو داده و از آلودگي های احتمالي پاكسازي مي كنيم.
• تجزیه و تحلیل: در این مرحله کیفیت و کمیت RNA استخراج شده را با استفاده از روشهای مختلف مانند اسپکتروفتومتری، الکتروفورز ژل آگارز، نانودراپ یا بایوانالایزر سنجش میکنیم.

کیت استخراج total RNA شرکت ماناتک:

کیت جداسازی total RNA یک روش ساده، سریع و مقرون به صرفه است که برای جداسازی RNA از نمونه های بافت، بافت پارافینه، خون و باکتری ارائه می شود. مواد شوینده و نمک کائوتروپیک برای لیز سلولی و غیر فعال کردن RNase استفاده می شود.

سیستم تخصصی بافر با غلظت نمک بالا به RNA اجازه می دهد که به دانه های مغناطیسی متصل شوند. ناخالصی ها به طور موثر شسته شده و RNA خالص بدون فنل یا رسوب با الکل شسته می شود. RNA خالص شده با این کیت برای انواع کاربردها از جمله RT-PCR، سنتز cDNA، مناسب است.

مزیت کیت ها:

فرایند استخراج 30 دقیقه ای، مناسب برای کارشناسان کم تجربه، طراحی پوسته تخصصی نانوذرات مغناطیسی جهت شارژ پذیری سریع با هدف کاهش زمان استخراج

شما میتوانید برای خرید محصول مناسب با پروژه خودتان پس از مطالعه متن بالا با کارشناسان حرفه ای ما مشورت کنید. شرکت ماناتک انواع کیت های استخراج ستونی و مگنتی را برای سهولت و تسریع  در  کار شما با قیمت مناسب و کیفیت بالا در اختیار شما میگذارد.