چگونه مستر میکس pcr بسازیم؟ برای ساخت یک مستر میکس اصلی PCR، باید حجم و اجزای مخلوط را در نظر بگیرید. به طور معمول، مخلوط اصلی PCR شامل اجزای زیر است:
DNA پلیمراز: یک DNA پلیمراز با کیفیت بالا و مناسب برای کاربرد خاص PCR خود انتخاب کنید. بافر: بافر pH و شرایط یونی بهینه را برای عملکرد موثر DNA پلیمراز فراهم می کند. dNTPs (دئوکسی نوکلئوزید تری فسفات): اینها بلوک های ساختمانی برای سنتز DNA هستند. پرایمرها: شامل پرایمرهای رو به جلو و معکوس مخصوص توالی DNA هدف شما می باشد. MgCl2 : کلرید منیزیم اغلب برای تامین کوفاکتور لازم برای فعالیت DNA پلیمراز گنجانده می شود.
در اینجا یک روش کلی برای ساخت مخلوط اصلی PCR آورده شده است:
حجم میکس اصلی مورد نیاز خود را بر اساس تعداد واکنش هایی که انجام خواهید داد، تعیین کنید. مقادیر مورد نیاز هر جزء را بر اساس غلظت نهایی مورد نیاز برای پروتکل PCR خاص خود محاسبه کنید. اجزاء را در یک لوله استریل به ترتیب توصیه شده زیر ترکیب کنید: بافر، dNTPs، پرایمرها، MgCl2، DNA پلیمراز و سپس آب بدون نوکلئاز برای رسیدن به حجم نهایی. اجزاء را کاملاً اما به آرامی با هم مخلوط کنید تا از یک ترکیب اصلی همگن بدون وارد کردن حباب هوا مطمئن شوید. در صورت تمایل، مخلوط اصلی را به حجم های کوچکتر تقسیم کنید و در دمای -20 درجه سانتیگراد یا -80 درجه سانتیگراد تا آماده استفاده نگهداری کنید.
برای اطمینان از غلظت ها و اجزای صحیح برای میکس اصلی خود، همیشه به دستورالعمل های پروتکل یا کیت PCR خاص مراجعه کنید. علاوه بر این، مطمئن شوید که در یک محیط تمیز و استریل کار کنید تا از آلودگی ترکیب اصلی جلوگیری کنید. علاوه بر این، هنگام ساخت یک مخلوط اصلی PCR، پیروی از شیوه های آزمایشگاهی خوب برای به حداقل رساندن احتمال آلودگی مهم است. برخی از نکات اضافی عبارتند از:
برای جلوگیری از آلودگی متقاطع از پیپت‌های مشخص شده و نوک پیپت‌های استریل با سر فیلتر برای هر جزء استفاده کنید. روی یک نیمکت تمیز کار کنید و در صورت وجود از هود با جریان آرام استفاده کنید. تمام لوله ها و مقدار کمی را به وضوح با محتویات، غلظت و تاریخ آماده شده برچسب بزنید. مخلوط اصلی را در دمای توصیه شده نگهداری کنید و از قرار گرفتن در معرض نور محافظت کنید، زیرا برخی از اجزای PCR ممکن است به تخریب ناشی از نور حساس باشند.
توجه به این نکته مهم است که حجم ها و غلظت های خاص اجزا در مخلوط اصلی می تواند بر اساس پروتکل PCR و الزامات خاص آزمایش متفاوت باشد. همیشه به پروتکل PCR خاص، دستورالعمل های کیت، یا ادبیات برای دقیق ترین و بهینه ترین فرمول ترکیب اصلی برای آزمایش خود مراجعه کنید. هنگام تهیه مخلوط اصلی PCR، اطمینان از اینکه همه معرف ها قبل از ترکیب کردن، ذوب شده و در دمای اتاق متعادل شده اند، ضروری است. این به جلوگیری از تغییرات غلظت به دلیل تفاوت در حالت های فیزیکی اجزا کمک می کند.
علاوه بر این، اگر حجم زیادی از مخلوط اصلی را برای استفاده برای واکنش‌های متعدد آماده می‌کنید، مهم است که میکس اصلی را قبل از تقسیم کردن کاملاً مخلوط کنید تا اطمینان حاصل شود که اجزا به طور مساوی توزیع شده‌اند. در نهایت، همیشه از حساسیت معرف های PCR به چرخه های انجماد و ذوب مکرر آگاه باشید. اگر با aliquots کار می‌کنید، برای حفظ یکپارچگی اجزای ترکیب اصلی PCR، به جای انجماد و ذوب مکرر همان مقدار، از aliquotهای جدید برای هر آزمایش استفاده کنید.
کلام آخر
چگونه مستر میکس pcr بسازیم، یکی از سوالات شما عزیزان می باشد که به آن برداخته شد،مستر میکس PCR (Polymerase Chain Reaction) یک محلول آماده است که شامل تمام مواد لازم برای انجام واکنش PCR است. این محلول شامل DNA پلیمراز، نوکلئوتیدها، پرایمرها، تمپلیت DNA و دیگر مواد ضروری است که برای تکثیر DNA در واکنش PCR لازم است. مهم است که دستورالعمل تهیه مستر میکس PCR را از کیت تجاری یا پروتکل مورد استفاده خود رعایت کنید و دقت کنید که مواد لازم به درستی اضافه شوند. همچنین، توصیه میشود که در شرایط بهینه دما و نگهداری دستگاه PCR را رعایت کنید تا بهترین نتایج را بدست آورید.
