استخراج DNA ژنومی از بافت های پارافینه (FFPE)

استخراج DNA از بافت پارافینه (FFPE)

استخراج DNA از بافت پارافینه (FFPE) یک روشی است که برای جداسازی و خالص سازی DNA از نمونه های بافتی که با فرمالین تثبیت شده و در پارافین جاسازی شده اند، استفاده میشود. این نمونه ها معمولاً در آزمایشگاه های پاتولوژی و بانک های بافت برای تشخیص و پژوهش ذخیره می شوند. استخراج DNA از این نمونه ها دارای چالش های خاصی است، زیرا فرمالین میتواند باعث تغییرات شیمیایی و فیزیکی در ساختار DNA شود و کیفیت و کمیت آن را کاهش دهد.

انواع روش های استخراج DNA از بافت پارافینه عبارتند از:

• روش استخراج بر اساس کلروفرم-فنل:

این روش یک تکنیک استخراج مایع-مایع است که با استفاده از ترکیبات شامل فنل، کلروفرم  DNA را از RNA، پروتئینها و دیگر ترکیبات سلولی جداسازي مي كند. این روش در بسیاری از آزمایشگاهها به عنوان روش استاندارد برای استخراج DNA از بافت پارافینه مورد استفاده قرار میگیرد.

• روش استخراج به روش ستون چرخشي مبتني بر غشاء سيليكا:

این روش، یکی از تکنیکهای استخراج DNA از نمونه های زیستی است که بر اساس اتصال DNA به غشاء ژل سیلیکا در حضور نمک و الکل کار میکند. این روش نسبت به روشهای دیگر مزایایی مانند سرعت، سادگی، کم هزینه بودن و عدم نیاز به حلال های سمی دارد.

برای استخراج DNA از بافت پارافینه با این روش، ابتدا باید بافت را از پارافین جدا کنید. برای این کار، میتوانید بافت را با آب گرم شستشو داده و سپس با الکل 70 درصد خشک کنید. سپس بافت را با چند قطره آب یا بافر لیز شده و در حالت جامد قرار دهید.

سپس مراحل زیر را برای استخراج DNA از بافت پارافینه دنبال کنید:

• بافت را در یک لوله مخصوص قرار داده و چند قطره از یک محلول حاوی پروتئین کیناز K (Proteinase K) و گوانیدین تیوسیانات (Guanidine thiocyanate) به آن اضافه کنید. این محلول باعث شکست پروتئین های موجود در بافت و آزاد شدن DNA می شود.
• لوله را در بن ماری 60 درجه سانتی گراد قرار داده و به مدت 10 تا 15 دقیقه با کمک همزن، نمونه را بهم بزنید. این کار باعث همگن شدن نمونه و خارج شدن DNA از بافت میشود.
• لوله را خنک کرده و به آن الکل (اتانول 96 درصد یا ایزوپروپانول) به همراه نمک (ستون آمونیوم) اضافه کنید. نسبت حجم الکل به حجم نمونه باید حدود 1.5 تا 2 باشد. الکل و نمک باعث میشود DNA به غشاء سیلیکا متصل شود و ناخالصی های دیگر جدا شوند.
• محلول را به یک ستون چرخشی حاوی غشاء سیلیکا منتقل کنید و سپس ستون را در سانتریفیوژ قرار داده و برای چند دقیقه در دور بالا بچرخانید. در این صورت، DNA به غشاء سیلیکا متصل شده و باقی مانده مواد در پایین لوله جمع میشود.
• سپس ستون را با چندین بافر شستشو، شستشو داده و مجدداً در سانتریفیوژ قرار دهید. این کار باعث میشود ناخالصی های باقیمانده از غشاء خارج شوند و فقط DNA با کیفیت بالا بماند.
• در نهایت، ستون را به یک لوله جمع آوری منتقل کنید و چند قطره از Elution buffer یا آب خالص به غشاء اضافه کنید. سپس ستون را دوباره در سانتریفیوژ قرار داده و برای چند دقیقه بچرخانید. در این صورت، DNA از غشاء جدا شده و به لوله جمع آوری منتقل میشود.

این روش یک روش ساده و کارآمد برای استخراج DNA از بافت پارافینه است که میتواند برای کاربردهای مختلف مولکولی مانند PCR، تکثیر ژن، تجزیه و تحلیل توالی و غیره استفاده شود.

نگهداری نمونه های پارافینه

نگهداری نمونه های پارافینه یک روش متداول و مفید است که برای حفظ و محافظت از بافت های زیستی در برابر تخریب و تغییرات آنتی ژن ها استفاده میشود. این روش به شما امکان میدهد که نمونه های خود را برای مدت طولانی (حتی چند ده سال) در شرایط مناسب نگهداری کرده و در زمان لازم برای انجام آزمایشات ژنتیکی، پاتولوژیکی، ایمونولوژیکی و غیره استفاده کنید.

برای نگهداری نمونه های پارافینه، شما باید مراحل زیر را دنبال کنید:

• تثبیت بافت: در این مرحله، شما باید بافت خود را با یک ماده ثابت کننده (معمولاً فرمالین) تحت فشار و دمای مناسب تزریق کرده و چند ساعت یا روز در آن نگه دارید. این کار باعث میشود که سلول ها و آنتی ژن های بافت به صورت ثابت و غیرفعال شوند و از تخریب جلوگیری شود.
• پردازش بافت: در این مرحله، شما باید بافت خود را از فرمالین خارج کرده و با استفاده از الکل، استون و پارافین، آب و چربی را از بافت حذف کنید. این کار باعث میشود که بافت خشک و سخت شده و برای قالب بندی آماده شود.
• قالب بندی بافت: در این مرحله، شما باید بافت خود را در یک قالب فلزی قرار داده و با پارافین مذاب پر کنید. این کار باعث میشود که بافت در یک بلوک پارافین جاسازی شده و شکل و ساختار خود را حفظ کند.
• برش دادن بافت: در این مرحله، شما باید با استفاده از یک دستگاه به نام میکروتوم، بلوک پارافین را به برش های نازک (حدود ۴ تا ۵ میکرومتر) تقسیم کنید. این کار باعث میشود که بافت قابل مشاهده تحت میکروسکوپ شود.
• لام گیری بافت: در این مرحله، شما باید برش های پارافین را روی گلاس لغزان قرار داده و با استفاده از حرارت، فشار یا لامل، آنها را به گلاس متصل کنید. این کار باعث میشود که بافت در جای خود ثابت شده و از جابجایی و خراب شدن جلوگیری شود.

با انجام این مراحل، شما میتوانید نمونه های پارافینه خود را در یک محیط پایدار و مناسب نگهداری کرده و در هر زمان که نیاز داشتید، برای انجام آزمایشات مختلف استخراج کنید. برای این کار، شما باید نمونه های پارافینه را با استفاده از مواد حلال (مانند زایلول یا تولوئن) از پارافین جدا کرده و سپس با استفاده از الکل، آبدهی و بازیابی آنتی ژن را انجام دهید. بعد از آن، شما میتوانید نمونه های خود را برای انجام تکنیک های مختلف مانند استخراج DNA، RNA، پروتئین، ایمونوهیستوشیمی، هیستوشیمی، فلورسانس و غیره آماده کنید.

بیشتر بخوانید:استخراج DNA آزاد سلولی

مواد تثبیت کننده بافت

مواد تثبیت کننده بافت، موادی هستند که برای محافظت از ساختار و عملکرد بافت های زیستی در برابر تخریب و تغییرات شیمیایی و زیستی استفاده میشوند. این مواد باعث میشوند که سلول ها و آنتی ژن های بافت به صورت ثابت و غیرفعال شوند و از اتولیز، فساد، هضم آنزیمی و حل شدن جلوگیری شود.

بسته به نوع بافت و هدف آزمایش، مواد تثبیت کننده بافت مختلفی مورد استفاده قرار میگیرند. برخی از این مواد تثبیت کننده بافت رایج عبارتند از:

• فرمالین: یک محلول آبی از فرمالدئید است که برای تثبیت بافت های پارافینه، سلول ها، خون و اسپرم استفاده میشود. فرمالین باعث حل شدن پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک شده و ساختار بافت را حفظ میکند. فرمالین ۱۰ درصد یک تثبیت کننده عالی برای روش های ایمونوهیستوشیمی است.
• الکل: یک حلال آلی است که برای تثبیت بافت ها، خون و اسپرم استفاده میشود. الکل باعث دناتوراسیون پروتئین ها و خشک شدن سلول ها شده و از رشد باکتری جلوگیری میکند. الکل ۹۵ درصد یک تثبیت کننده مناسب برای روش های هماتوکسيلین-ائوزین است.
• استون: یک حلال آلی است که برای تثبیت بافت های چرب، خون و اسپرم استفاده میشود. استون باعث دناتوراسيون پروتئين ها و حذف چربي ها شده و از رشد باكتري جلوگيري مي كند. استون ۱۰۰ درصد يك تثبيت كننده مناسب است.

مشخصات کیت های استخراج DNA بافت پارافینه(FFPE) شرکت ماناتک:

کیت های استخراج DNA از بافت پارافینه شرکت ماناتک با روش ستونی، روشی سریع برای جدا و خالص سازی محتوای ژنومی نمونه های بافت پارافینی که با فرمالین تثبیت شده اند، هستند و استفاده از فرمالین در تثبیت بافت ها منجر به کراسلینک اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها می شود. DNA از سایر اجزای سلولی بدون استفاده از فنل یا کلروفرم خالص می شد که میتواند در تکنیک های PCR، q-PCR، هیبریداسیون، ساترن بلات و روش هضم اندونوکلئاز محدود کاربرد دارند.

مزیت های این کیت ستونی شامل:

نیمه عمر بالا، حاوی محلول پارافین زدا جایگزین گزیلول، بکارگیری ترکیبات غیر سمی در فرایند شست و شو و ترکیبات شیمیایی سازگار با مواد زیستی برای حذف آلودگی های DNA می باشد.

شما میتوانید برای خرید محصول مناسب با پروژه خودتان پس از مطالعه متن بالا با کارشناسان حرفه ای ما مشورت کنید. شرکت ماناتک انواع کیت های استخراج و دستگاه ترمال سایکلر PCR را برای سهولت و تسریع در کار شما با قیمت مناسب و کیفیت بالا در اختیار شما میگذارد.