مشاوره خرید لدر (Ladder)

 لدر چیست؟

PCR DNA Ladder یک لدر dsDNA وسیع با باندهای 100 جفت باز تا 3000 جفت باز است. از لدر می توان برای کمی کردن مقدار DNA در یک نمونه استفاده کرد زیرا جرم DNA در هر باند در لدر به 10 نانوگرم DNA کالیبره شده است به جز باند 1000 جفت باز که حاوی 30 نانوگرم DNA است.

نردبان DNA یک نشانگر مولکولی با اندازه استاندارد یا قطعاتی از DNA است که برای تعیین اندازه آمپلیکون های PCR استفاده می شود. 50bp، 100bp، 1000bp و 3000bp چندین نشانگر تجاری در دسترس و محبوب هستند.

ران کردن یک لدر DNA در کنار یک محصول ناشناخته PCR در یک ژل آگارز، به محققان این امکان را می‌دهد تا اندازه قطعه DNA ناشناخته را با مقایسه آن با نزدیک‌ترین نوار اندازه در خط نردبان تخمین بزنند.

لدر در الکتروفورز

هدف استفاده از نشانگرها یا لدرها در طول الکتروفورز این است که این لدرها اندازه مولکول را تشخیص داده و اندازه گیری  کنند. این نشانگرها یا لدرها گروه منحصر به فردی از استانداردها هستند که حاوی مجموعه ای از مقادیر شناخته شده می باشند که برای مطابقت با اندازه مولکولی که در طول الکتروفورز روی ژل اجرا می شود، استفاده می گردد. لدر (DNA) یا نشانگر همیشه در اولین چاه ژل الکتروفورز بارگذاری می شود. استفاده از لدر DNA در یکی از خطوط ژل به کشف اندازه تقریبی نمونه های DNA در خطوط دیگر کمک می کند.

مزایای استفاده از لدرDNA

لدرهای DNA برای اندازه گیری دقیق DNA و تعیین کمیت تقریبی ایده آل هستند. جرم مولکولی لدرهای DNA از مخلوط های هم مولی قطعات DNA تشکیل شده اند و به طور خاص برای تخمین کمی جرم DNA در ژل ها ایجاد می شوند.

قطعات مختلف سرعت اجرای متفاوتی دارند، قطعات بزرگتر کندتر اجرا می شوند در حالی که قطعات کوچکتر سریعتر اجرا می شوند. بنابراین از نظر فنی، بدون مرجع یا نشانگر اندازه استاندارد، نمی‌توانیم اندازه یک قطعه را بفهمیم!

بنابراین بدون هیچ مرجعی; اجرای ژل منطقی نیست، لدر DNA به سادگی ترکیبی از قطعات با اندازه استاندارد است که بر اساس اندازه قطعه آنها اجرا می شود. این به تعیین اندازه قطعات DNA کمک می کند. مانند لدر DNA، لدر RNA و پروتئین وجود دارد و در آزمایش های مختلف بیولوژیکی استفاده می شود.

لدر یا نشانگر DNA به ما ایده ای در مورد

• اندازه قطعه DNA
• نوع آزمایش- تقویت PCR یا تعیین توالی DNA.
• هموزیگوت را از هتروزیگوت تشخیص دهید.
• به درک نتایج نمونه های تشخیصی کمک کنید.
• هر قطعه از لدر باید از یکدیگر جدا شود.
• هر قطعه دارای غلظت کافی برای تجسم قطعه روی یک ژل است.
• ترکیب رنگ بارگذاری ژل DNA نباید بر ویژگی لدر DNA تأثیر بگذارد.
• لدر باید به اندازه کافی پایدار باشد تا بتوان برای مدت زمان طولانی تری از آن استفاده کرد.
• نردبان باید بسیار خالص باشد (نردبان DNA خالص مبتنی بر کروماتوگرافی را ترجیح دهید). اگر حاوی قطعات غیر ضروری یا ناشناخته است از آن استفاده نکنید (در این صورت با سازنده تماس بگیرید).

تأثیر شرایط ژل سازی بر لدر

• لدر DNA ترکیبی از قطعات مختلف DNA با اندازه شناخته شده است که بسیار شبیه آمپلیکون های ما است و بنابراین شرایط ژل و بافرهای ساخته شده تأثیر مستقیمی روی آن دارد.
• حرکت لدر DNA به غلظت بافر، ولتاژ، غلظت ژل و ترکیبات رنگ بارگذاری ژل بستگی دارد.
• در حالت ایده آل، غلظت 1X بافر الکتروفورز ژل کافی است. اگر غلظت بافر افزایش یابد، غلظت اضافی از حرکت و جدا شدن لدر DNA جلوگیری می کند.
• PCR DNA Ladder در بافر بارگیری عرضه می شود که آماده استفاده بر روی ژل های DNA آگارز و SDS می باشد. PCR DNA Ladder برای هر دو سیستم الکتروفورز TBE و TAE مناسب است.
• غلظت ژل در حال اجرا، اهمیت و تأثیر مهمی بر حرکت قطعات دارد. غلظت بیش از حد ژل به طور غیر ضروری باعث می شود DNA سریعتر حرکت کند، این اتفاق منجر به الگوی باند با کیفیت، بد می شود.
• به عنوان مثال، اگر از ژل آگارز 2 درصد استفاده می کنید، از لدر DNA 3000 جفت باز (3 کیلوبایت) استفاده نکنید زیرا یک قطعه 3 کیلوبایتی نمی تواند به درستی حرکت کند. بنابراین، لدر 3 کیلوبایتی انتخاب صحیحی برای الکتروفورز ژل آگارز آمپلیکون‌های PCR نیست.
• ژل 2 درصدی نمی تواند قطعات 10 جفت باز یا 50 جفت باز از نردبان DNA را جدا کند، بنابراین استفاده از لدر 10 جفت باز ارزشی ندارد. آن قطعات ممکن است قابل مشاهده نباشند. DNA لدر 10 جفت باز یا 50 جفت باز به طور ایده آل برای ژل 3 درصد و PAGE توصیه می شود.
• هرچه درصد آگارز بیشتر باشد، اندازه منافذ کوچک‌تر است، بنابراین مولکول‌های کوچک‌تر می‌توانند عبور کنند و مهاجرت کندتر می‌شود. در آزمایشگاه بیولوژی مولکولی، ژل آگارز 0.7-1٪ معمولاً برای جداسازی DNA روزانه استفاده می شود، که تمایز خوب و واضح قطعات را در محدوده 0.2-10 kb ارائه می دهد.

جریان الکتریکی عامل دیگری است که به اندازه بافر حیاتی است.

• در حالت ایده‌آل، ژل 5 تا 10 ولت بر سانتی‌متر توسط متخصصان توصیه می‌شود، با این حال، اگر ولتاژ افزایش یابد، قطعات DNA سعی در حرکت سریع دارند که منجر به برش باندهای DNA می‌شود.
• ژل را در شرایط ولتاژ مناسب اجرا کنید. در حالت ایده آل، 50 تا 80 ولت برای ژل 2 درصد توصیه می شود.

لدر از چه ماده ای ساخته شده است؟

• دو طرف لدرDNA از واحدهای قند دی اکسید و فسفات یکی پس از دیگری تشکیل شده است.
• پله های لدر DNA از بازهای نیتروژنی تشکیل شده است که آدنین، تیمین، سیتوزین و گوانین هستند. گوانین و آدنین بازهای پورینی هستند در حالی که سیتوزین و تیمین بازهای پیریمیدین هستند.
• آدنین با تیمین دو پیوند هیدروژنی ایجاد می کند در حالی که گوانین با سیتوزین سه پیوند هیدروژنی تشکیل می دهد و پله های نردبان DNA را تشکیل می دهد.

اما نردبان های DNA بسیار متفاوتی وجود دارد! چگونه بهترین را برای آزمایش خود انتخاب می کنید؟

بیشتر بخوانید:مشاوره خرید دستگاه ریل تایم PCR

محدوده اندازه

مهمترین عامل در انتخاب یک لدر DNA، اندازه مورد انتظار نوارهای DNA در آزمایش شما است. شما می خواهید مطمئن شوید که محدوده لدر DNA، از کوچکترین تا بزرگترین قطعه آن، شامل اندازه مورد انتظار قطعات DNA است که آزمایش می کنید. برای مثال، اگر منتظر قطعات کوچک DNA با 50 جفت باز(bp)  هستید، باید مطمئن شوید که لدر DNA انتخابی دارای نوارهایی حداقل به این کوچکی است. از طرف دیگر، اگر یکی از نمونه‌های شما حاوی قطعه DNA بزرگ 3 کیلوباز(kb) باشد، باید مطمئن شوید که لدر DNA انتخابی شما دارای نوارهایی به این بزرگی است.

تعداد باندها در محدوده اندازه معین

نکته مهم دیگر تعداد نوارهای لدر در محدوده اندازه معین است. استفاده از لدر با باندهای بیشتر در محدوده مشخص، تخمین دقیق اندازه قطعات DNA در نمونه های شما را آسان تر می کند. با این حال،  است که برای تفسیر واضح لدر با نوارهای بیشتر، باید ژل را طولانی تر اجرا کنید. اگر دانستن اندازه دقیق یک باند مهم است، لدری با نوارهای بیشتر انتخاب کنید و ژل خود را برای مدت طولانی تری ران کنید. اگر زمان محدود است، یا تخمین تقریبی اندازه باند کافی است، لدری را انتخاب کنید که باندهای زیادی نداشته باشد.

تفاوت بین نردبان 100 bp و نردبان 1 کیلوبایتی چیست؟

لدر 1 کیلوبایتی برای اندازه گیری قطعات DNA دو رشته ای خطی از 250 جفت باز تا 10 کیلوبایت مناسب است. باندهای 1 kb و 3 kb حاوی DNA بیشتری برای ارائه جهت گیری داخلی هستند. لدر DNA 100 جفت باز برای اندازه گیری قطعات DNA دو رشته ای خطی از 100 جفت باز تا 1500 جفت باز مناسب است.

چه مقدار لدر DNA باید بارگذاری کنم؟

برای یک سیستم الکتروفورز استاندارد، توصیه می کنیم 0.5 میکروگرم (20 میکرولیتر) از DNA Ladder را روی ژل آگارز قرار دهید. برای یک سیستم الکتروفورز (5 تا 30 دقیقه جداسازی)، توصیه های سازنده را دنبال کنید: 5 تا 20 میکرولیتر. ممکن است نیاز به رقیق کردن نردبان باشد.

به طور میانگین قیمت این محصول از18-26 دلار می باشد (بستگی به برند و نوع محصول دارد)

شما عزیزان میتوانید بر داشتن اطلاعات بیشتر و خرید دستگاه ترمال سایکلر  و همچنین برای مشاوره تست های مولکولی و خرید مواد مولکولی با کارشناسان ما در شرکت مانا تک در تماس باشید.