سنتز cDNA

سنتز cDNA یک فرآیند آنزیمی است که با استفاده از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (RT) و تشکیل DNA مکمل (cDNA) از RNA پیام رسان (mRNA) است. این فرآیند به عنوان ژنتیک معکوس شناخته میشود و برای بررسی بیان ژن ها، کلونینگ ژن ها، ساخت کتابخانه های cDNA و غیره کاربرد دارد.

در این فرآیند، ابتدا RNA استخراج شده از نمونه های بیولوژیکی را با استفاده از روش های مناسب خالص میکنند. سپس با اضافه کردن پرایمر، dNTP و آنزیم RT به نمونه ها، واکنش RT-PCR را در دستگاه ترمال سایکلر اجرا میکنند. در این واکنش، آنزیم RT با استفاده از پرایمر به عنوان الگو، یک رشته DNA را بر روی رشته mRNA سنتز میکند. سپس با حذف mRNA یا تولید رشته دوم DNA، cDNA دو رشته ای به دست می آید. cDNA دارای توالی همان ژن مورد نظر است ولی بدون قطعات غیر کد کننده (intron) است.

کاربردهای سنتز cDNA عبارتند از:

• بررسی بیان ژن ها: با سنتز cDNA میتوان مقدار و نوع mRNA های تولید شده توسط ژن هدف را در شرایط مختلف سلولی، بافتی یا فیزیولوژیک اندازه گیری کرد. برای این منظور، معمولاً از روش RT-qPCR (Real-Time Quantitative PCR)  استفاده میشود که با استفاده از نشانگرهای فلورسانس، مقدار  cDNA در هر دوره PCR را نشان میدهد.
• کلونینگ ژن ها: با سنتز cDNA میتوان ژن های یوکاریوتی را در پلاسمید های باکتریال قرار داد و آن ها را در سلول های باکتری تکثیر کرد. به این ترتیب، میتوان یک کپی دقیق از ژن هدف را در دسترس داشت و از آن برای مطالعه توالی، ساختار، عملکرد و تعاملات ژنی استفاده کرد.
• ساخت کتابخانه های cDNA: با سنتز cDNA میتوان کلیه mRNA های یک بافت یا سلول را به cDNA تبدیل کرد و آن ها را در پلاسمید های مختلف قرار داد. به این ترتیب، میتوان یک مجموعه از cDNA های مربوط به ژن های فعال در یک بافت یا سلول را در اختیار داشت و از آن برای بررسی تنوع ژنتیکی، تکامل، تفاوت بافتی و غیره استفاده کرد.

انواع کیت سنتز One step و Two step

کیت سنتز One step:  این کیت یک روش ساده و سریع است که با استفاده از آن میتوان در یک مرحله و در یک تیوب، هم RT و هم PCR را انجام داد. در این روش، mRNA را با پرایمر مناسب، dNTP ها، آنزیم RT و آنزیم DNA پلیمراز در یک بافر مناسب قرار میدهند و در دستگاه ترمال سایکلر قرار میدهند. در این دستگاه، با تغییر دما، ابتدا RT انجام شده و cDNA تک رشته ای ساخته میشود. سپس PCR انجام شده و cDNA دو رشته ای تولید میشود. این روش برای سنجش بیان ژن ها با استفاده از RT-qPCR مناسب است.

بیشتر بخوانید:دستگاه دیجیتال pcr

کیت سنتز Two step:  این کیت یک روش جداگانه است که با استفاده از آن میتوان در دو مرحله و در دو تیوب، RT و PCR را انجام داد. در این روش، mRNA را با پرایمر مناسب، dNTP ها و آنزیم RT در یک بافر مناسب قرار میدهند و در دستگاه ترمال سایکلر قرار میدهند. در این دستگاه، فقط RT انجام شده و cDNA تک رشته ای ساخته میشود. سپس cDNA تک رشته ای را با پرایمر خاص، dNTP ها و آنزیم DNA پلیمراز در یک بافر مناسب قرار میدهند و در دستگاه ترمال سایکلر قرار میدهند. در این دستگاه، فقط PCR انجام شده و cDNA دو رشته ای تولید میشود. این روش برای کلونینگ ژنها با استفاده از پلاسمید مناسب است.

برای بررسی کیفیت cDNA، روشهای مختلفی وجود دارد که عبارتند از:

• بررسی cDNA با PCR معمولی: در این روش، cDNA را با استفاده از پرایمرهای خاص برای یک ژن مرجع (Housekeeping) که میزان بیان آن در همه سلول ها تحت هر شرایطی یکسان است، PCR گذاشته و نتیجه را روی ژل آگارز مشاهده میکنند. اگر باند واضح و در جایگاه درست از لحاظ طولی قرار گرفته باشد، نشان دهنده کیفیت خوب cDNA است.
• بررسی cDNA با RT-qPCR :  در این روش، cDNA را با استفاده از پرایمرهای خاص برای ژن هدف و ژن مرجع، تکنیک RT-qPCR انجام داده و نتیجه را با استفاده از نشانگرهای فلورسانس و نرم افزار مناسب تحلیل میکنند. اگر Melt curve یک قله تک و در دمای مناسب داشته باشد، نشان دهنده کیفیت خوب cDNA است.
• بررسی cDNA با سکانس: در این روش، cDNA را با استفاده از پرایمرهای خاص برای ژن هدف، برای انجام سکانس sangerیا NGS  ارسال می شود و نتيجه را با استفاده از نرم افزار مناسب تحليل مي كنند. اگر توالي cDNA با توالي ژن هدف همخواني داشته باشد، نشان دهنده كيفيت خوب cDNA است.

انواع پرایمرها برای سنتز cDNA عبارتند از:

• پرایمر Oligo (dT): این پرایمر یک توالی غنی از نوکلئوتید تیمین است که به قسمت پایانی ’3 mRNA که دارای دم پلی A است، باند میشود. این پرایمر فقط برای سنتز cDNA از روی mRNA مناسب است و مزیت آن این است که فقط قسمت کد کننده mRNA را شامل میشود.
• پرایمر Random hexamer: این پرایمر یک توالی تصادفی شش نوکلئوتیدی است که به صورت تصادفی به نقاط مختلف RNA باند میشود. این پرایمر برای سنتز cDNA از روی هر نوع RNA مناسب است و مزیت آن این است که تمام طول RNA را شامل میشود.
• پرایمر specific: این پرایمر یک توالی خاص برای ژن هدف است که به قسمت پایانی ’3 cDNA باند میشود. این پرایمر فقط برای سنتز cDNA از روی mRNA مناسب است و مزیت آن این است که فقط قسمت خاص mRNA را شامل میشود.

انواع ترانس کریپتازهای معکوس

• ترانس کریپتاز معکوس رترو ویروسی: این نوع آنزیم توسط ویروسهای رترو رمزگذاری میشود. این آنزیم سه فعالیت بیوشیمیایی دارد: فعالیت DNA پلیمراز وابسته به RNA، فعالیت ریبونوکلئاز H و فعالیت DNA پلیمراز وابسته به DNA با استفاده از این فعالیتها، این آنزیم میتواند RNA تک رشته ای را به cDNA دو رشته ای تبدیل کند.
• ترانس کریپتاز معکوس هپادا ویرال: این نوع آنزیم توسط ویروسهای هپادا، مانند هپاتیت B، رمزگذاری میشود. این آنزیم فقط فعالیت DNA پلیمراز وابسته به RNA دارد و نمیتواند فعالیت ریبونوکلئاز H یا DNA پلیمراز وابسته به DNA داشته باشد. با استفاده از این فعالیت، این آنزیم میتواند RNA را به عنوان الگو برای سنتز cDNA تک رشته ای استفاده کند.
• ترانس کریپتاز معکوس تلومراز: این نوع آنزیم توسط سلولهای گیرنده، مانند سلولهای جنین، سلولهای بنفشه، سلولهای سرطان و سلولهای جلبک، رمزگذاري مي شود. اين آنزيم فقط فعاليت DNA پليمراز وابسته به RNA دارد و نياز به يك پرايمر خود الگوري (self-priming) دارد. با استفاده از اين فعاليت، اين آنزيم مي تواند قسمت هاي پاياني ’5 DNA كروموزوم ها (telomere) را بافت كند.

معرفی کیت های سنتز cDNA شرکت ماناتک:

این کیت ها شامل یک ریجنت میکس شامل تمام اجزای ضروری برای تغییر total RNA یا mRNA به cDNA شامل: H-minus MMLV مقاوم به حرارت، RNase Inhibitor، RT buffer و dNTP، MgCl2، Oligo d(t)16، رندوم هگزامر و نگهدارنده می باشد.

کلام آخر:

شما میتوانید برای خرید محصول مناسب با پروژه خودتان پس از مطالعه متن بالا با کارشناسان حرفه ای ما تماس حاصل فرمایید. شرکت ماناتک انواع کیت های استخراج را برای سهولت و تسریع در کار شما با قیمت مناسب و کیفیت بالا در اختیار شما میگذارد.