استخراج DNA ویروسی

استخراج DNA ویروسی

استخراج DNA ویروسی که برای انجام تکنیک PCR مورد نیاز می باشد، فرایندی است که طی آن DNA ویروسها از سلولهای میزبان یا محیطهای غیرسلولی جداسازی میشود. این فرایند برای بسیاری از کاربردهای بالینی، تشخیصی، پژوهشی و صنعتی مهم است.

ژنوم ویروس ها

ژنوم ویروس، ماده ژنتیکی است که اطلاعات لازم برای تولید و تکثیر ویروس را شامل می شود. ژنوم ویروسها ممکن است از نوع DNA یا RNA باشد و ممکن است تک رشته ای یا دورشته ای، خطی یا حلقوی، ساده یا پیچیده باشد. بر اساس نوع ژنوم، ویروسها به دسته های مختلف تقسیم میشوند که  از جمله آن ها ویروسهای DNA دار هستند.

 ویروس های DNA دار

 این دسته شامل ویروسهایی است که ژنوم آنها از DNA تشکیل شده است. این ویروسها معمولاً از DNA دورشته ای خطی تشکیل شده اند، اما برخی از آنها ممکن است DNA تک رشته ای خطی یا حلقوی داشته باشند. برخی از مثالهای این دسته عبارتند از: هرپس ویروس، پاپیلوما ویروس، هپاتیت B و پاروو ویروس.

برخی از روشهای رایج برای استخراج DNA ویروسی عبارتند از:

روش های دستی

• روش جوشاندن: این روش شامل جوشاندن نمونه در حضور چگال کننده های ژل مانند ژلاتین است. در دمای بالا، سلولهای میزبان و ویرال شکسته شده و DNA آزاد میشود. پس از خنک کردن، DNA در حالت ژل درآید و با الکتروفورز جداسازی میشود. این روش بسیار ساده و سریع است، اما خالص نبودن DNA را به همراه دارد.

• روش استخراج بر اساس کلروفرم-فنل: این روش یک تکنیک استخراج مایع-مایع است که با استفاده از ترکیبات شامل فنل، کلروفرم و گوانیدین تیوسیانات (GITC)، RNA را از DNA، پروتئینها و دیگر ترکیبات سلولی جداسازي مي كند. در این روش، نمونه بافت یا سلول همگن سازي شده و سپس با فنل و کلروفرم مخلوط مي شود. این باعث مي شود که فازهای مختلف تشکيل شود که در آن RNA به فاز آبي منتقل شود. سپس RNA را با الکل رسوب داده و شستشو داده و حلال سازي مي كنيم.

روش استخراج فاز جامد و مزایا (کیت های ستونی)

  روش استخراج فاز جامد یک روش نوین و کارآمد برای استخراج DNA و RNA است که در بسیاری از کیتهای تجاری گنجانده شده است. این روش مزایایی مانند سادگی، سرعت، قابل اتوماسیون بودن، خلوص بالا، کارایی بالا، عدم نیاز به فنل یا کلروفرم و قابلیت استخراج DNA و RNA همزمان دارد.  روش استخراج فاز جامد برای استخراج DNA و RNA از نمونه های ویروسی مناسب است زیرا ویروسها مقدار کمی از DNA یا RNA دارند و نسبت سطح به حجم بالای آنها باعث میشود که DNA یا RNA آنها به راحتی به ستون جذب شود. همچنین، استخراج DNA یا RNA از ویروسها نیاز به لیز کامل غلاف و کپسید آنها دارد که با روش استخراج فاز جامد به خوبی صورت میگیرد. بنابراین، روش استخراج فاز جامد گزینه مناسبی برای استخراج DNA و RNA از نمونه های ویروسی است و روش های دیگر مانند روش فنول-کلروفرم گزینه کمتر مناسبی هستند.

چالش های موجود در روش استخراج فاز جامد

روش استخراج فاز جامد همچنین چالشهایی مانند نیاز به عاملهای chaotropic، آلودگی DNA با RNA یا پروتئین، تغییر pH، تجزیه DNA یا RNA توسط DNase یا RNase و نگهداری نامناسب دارند.

 روش دانه های مغناطیسی:

 این روش یک روش جدید و ساده برای استخراج DNA و RNA است که بر اساس تعامل دانه های مغناطیسی با DNA و RNA کار میکند. در این روش، نمونه با چندین عامل شکسته شده تا محتوای ژنتیکی آزاد شود و سپس با دانه های مغناطیس پوشیده شده با پروپیدین گالات مخلوط شده و تحت میدان مغناطیسی قرار میگیرد. در این صورت، DNA و RNA به دانه های مغناطیسی متصل شده و از بقیه مواد جدا میشوند. سپس با شستشو کردن دانه های مغناطیسی با چندین حلال، DNA و RNA از آلودگی  ها پاک شده و با حلال مناسب (مثل آب یا بافر TE) از دانه های مغناطیسی جدا شده و الوت یا حذف میشوند.

بیشتر بخوانید:استخراج DNA آزاد سلولی

• روش دستگاه مبتنی بر کاغذ: این روش یک روش نوآورانه و ارزان برای استخراج DNA و RNA است که بر اساس استفاده از کاغذ به عنوان یک زیرلایه برای جذب DNA و RNA کار میکند. در این روش، نمونه با چندین عامل شکسته شده تا محتوای ژنتیکی آزاد شود، سپس با یک کاغذ فیلتر  مثل Whatman No.1) ) فیلتر شده است. در این صورت، DNA و RNA به کاغذ فیلتر جذب شده و از بقیه مواد جدا میشوند. سپس با شستشو کاغذ فیلتر با چندین حلال، DNA و RNA از آلودگیها پاک شده و با حلال مناسب مثل آب یا بافر TE  از کاغذ فیلتر جدا شده و الوت میشوند.

این روشها هر کدام مزایا و معایب خود را دارند که بستگی به نوع نمونه، هدف، بودجه و تجهیزات مورد نظر دارد. برای مثال، روش فنول-کلروفرم خلوص بالای DNA و RNA را تضمین میکند اما نسبت به روشهای دیگر زمانبر، خطرناک و هزینه بر است. روش دانه های مغناطیسی سادگی، سرعت و قابل اتوماسیون بودن را دارد اما نسبت به روشهای دیگر هزینه برتر است. روش دستگاه مبتنی بر کاغذ ارزان، ساده و قابل حمل است اما نسبت به روشهای دیگر خلوص پایین تر و تجزیه و تحلیل سخت تر است.

برخی از خطا های ممکن در تکنیک استخراج DNA عبارتند از:

• خطای جمع آوری سلول: اگر نمونه های سلولی به طور نامناسب یا ناکافی جمع آوری شوند، ممکن است باعث کاهش کیفیت و کمیت DNA شوند. برای جلوگیری از این خطا، باید روشهای مناسب و استاندارد را برای جمع آوری و نگهداری نمونه های سلولی رعایت کرد.

• خطای لیز سلول: اگر غشای سلول و هسته به طور کامل شکسته نشوند، ممکن است باعث ممانعت از دسترسی به DNA شوند. برای جلوگیری از این خطا، باید مقادیر مناسب و کافی از مواد شوینده و چائوتروپیک را به محلول لیز اضافه کرد.

• خطای غیرفعال سازی DNase و RNase اگر DNase و RNase : در محلول لیز فعال باقی بمانند، ممکن است باعث تخریب یا تغییر DNA شوند. برای جلوگیری از این خطا، باید حلالهای آلی یا حرارت را برای غیرفعالسازی DNase و RNase استفاده کرد

• خطای تخلیص: DNA اگر RNA، لیپیدها، پروتئینها و سایر آلودگی ها به طور کامل از DNA جدا نشوند، ممکن است باعث تغییر خصوصیات فیزیکی و شیمیایی DNA شوند. برای جلوگیری از این خطا، باید روشهای مناسب و دقیق را برای تخلیص DNA از آلودگیها استفاده کرد.

• خطای اندازه گیری خلوص و غلظت: DNA اگر دستگاه طيف سنج UV به طور صحيح كاليبراسيون نشده باشد يا عاملهای مختل كننده در محيط باشند، ممكن است باعث كاهش دقت در اندازه گيري جذب UV شده و نتيجه غير قابل اعتمادي را نشان دهد. برای جلوگیری از این خطا، باید دستگاه طيف سنج UV را به طور منظم كاليبراسيون كرده و محلول DNA را از آلودگیهای محتمل پاک نگه دارید.

معرفی کیت استخراج DNA ویروسی ستونی شرکت ماناتک:

این کیت می تواند DNA ویروسی را از بافت سرم یا پلاسما، بزاق و سواب بینی  و بافت استخراج کند و در تکنیک های PCR، RFLP و مطالعات هیبریداسیون کاربرد دارد.

این کیت  میتواند حداکثر حذف پروتئین ها و سایر ناخالصی ها را فراهم کند. مقدار اسید نوکلئیک ویروسی که خالص می شود به نوع و منبع نمونه، تیتر ویروس و شرایط نگهداری بستگی دارد.

از جمله مزیت های کیت های شرکت ماناتک:

نیمه عمر بالای کیت، خدمات پس از فروش و بکارگیری ترکیبات شیمیایی سازگار با مواد زیستی جهت حذف آلودگی های RNA

شما میتوانید برای خرید محصول مناسب با پروژه خودتان پس از مطالعه متن بالا با کارشناسان حرفه ای ما مشورت کنید. شرکت ماناتک انواع کیت های استخراج ستونی را برای سهولت و تسریع درکار شما با قیمت مناسب و کیفیت بالا در اختیار شما میگذارد.