استخراج DNA به روش نمکی (salting out)
روش salting out
یک روش شیمیایی است که بر اساس این اصل کار می کند که DNA در حضور نمک های اشباع غیر قابل حل است و به صورت رسوب جدا می شود. این روش برای استخراج DNA از نمونه های مختلف مناسب است، به شرط آن که نمونه ها دارای سلول های دارای هسته باشند (گلبول های سفید). برخی از نمونه هایی که می توان با این روش DNA را از آن ها جداسازی کرد، عبارتند از: خون، بافت و مغز استخوان.
به طور کلی این روش شامل:
لیز کردن سول ها با شوینده یا دترجنت، رسوب دادن یا حذف پروتئین ها به کمک پروتئیناز K و نمک و رسوب DNA با اتانول یا ایزوپروپانول و حل کردن DNA می باشد.
مراحل انجام استخراج DNAبه روش نمکی
میزان 2 ml خون تازه تام را (مانندروش فنول کلروفرم) داخل فالکون ml 15 ریخته و سپس 3-2 برابر حجم خون به آن آب مقطر اضافه می کنیم. به مدت 1 دقیقه نمونه ها را shake کرده و سپس آن ها را به مدت نیم ساعت در فریزر -20 درجه می گذاریم. سپس فالکون ها را به مدت 5 دقیقه با دورrpm 5000 سانتریفیوژ می کنیم.
WBC ها در انتهای فالکون جمع می شوند و RBC های لیز شده بر روی سطح بالایی قرار می گیرند. مایع رویی را به نحوی که2 ml خون در فالکون باقی می ماند را خالی می کنیم و به نمونه، آب مقطر اضافه می کنیم و مجدد 1 دقیقه shake کرده و این بار به مدت 15 دقیقه داخل فریزر می گذاریم.
مجدد نمونه را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی را به نحوی که ml 2 بماند خالی می کنیم. برای بار سوم آب به رسوب اضافه کرده و فالکون را shake کرده و نمونه را مستقیما سانتریفیوژ می کنیم. این بار فالکون را inverse کرده تا محلول رویی کاملا خارج شود. (فقط رسوب در کف فالکون بماند)
به رسوب گلبول های سفید، 600 میکرولیتر بافر لیزکننده هسته (Tris-Nacl-EDTA) اضافه می کنیم. سپس 50 میکرولیتر SDS و 20 میکرولیتر پروتئیناز K اضافه می کنیم. نمونه را به همراه ترکیبات اضافه شده به مدت 16-12 ساعت به صورت Overnight در دمای 37 درجه و یا به مدت 1 ساعت در دمای 60 درجه انکوبه می کنیم. بعد از اینکه گلبول های سفید کاملا در بافر لیز حل شد و یک محلول یکنواخت به وجود آمد 600 میکرولیتر NACl به آن اضافه می کنیم. (سدیم کلرید به حذف پروتئین های متصل شده به DNA کمک می کند)
فالکون را 15 ثانیه shake کرده و با دور 4000 rpm به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم. بعد از سانتریفیوژ می بینیم که DNA به صورت محلول قرار گرفته و بقایای سلولی در انتهای فالکون جمع شدند.
بیشتر بخوانید:استخراج DNA آزاد سلولی (cfDNA)
مایع رویی را به فالکون جدید منتقل می کنیم. این بار 400 میکرولیتر NACl 6 مولار به محلول رویی اضافه می کنیم. بار دیگر فالکون را 15 ثانیه shake کرده و 15 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم. مراحل بعدی میتواند به ترجیح خود داخل فالکون یا میکروتیوب ادامه یابد.
مایع رویی را بین 2 میکروتیوب 1.5 به طور مساوی تقسیم کرده و به هر کدام 600 میکرو لیتر الکل پروپانول اضافه می کنیم. چند مرتبه میکروتیوب ها را به آرامیinverse کرده تا کلاف DNA ظاهر شود. سپس آن ها را در دور 12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم تا DNA در کف میکروتیوب رسوب بدهد.
الکل رویی را با inverse کردن خارج کرده و به آن 200 لاندا اتانول 75 درصد اضافه می کنیم. میکروتیوب با دور 14000 rpm به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کرده و مراحل شستشو را برای اطمینان یک بار دیگر تکرار می کنیم. (الکل اضافه کرده و سانتریفیوژ کرده و محلول رویی را out می کنیم) و برای اطمینان از خروج اتانول به صورت کامل، میکروتیوب ها را در دمای 56 روی دستگاه dry block قرار می دهیم.
سپس 50 میکرولیتر بافر TE به هر کدام اضافه کرده و درب نمونه ها را می بندیم و تا زمانی که DNA با محلول TE کاملا ترکیب شود روی دستگاه می ماند. برای سنجش کمی و کیفی DNA از دستگاه نانودراپ استفاده می کنیم)
روش تهیه بافر لیز کننده گلبول قرمز در روش نمکی استخراج DNA
بافر لیزکننده گلبول قرمز یک محلول شیمیایی است که برای لیز کردن و حذف کردن گلبول های قرمز خون از نمونه های خونی استفاده می شود. این بافر شامل نمک ها و مواد شیمیایی دیگری است که باعث می شوند گلبول های قرمز خون اسمز رخ دهند، تورژسانس پیدا کنند و پاره شوند. این اتفاق باعث می شود که DNA فقط در گلبول های سفید خون باقی بماند و بتوان آن را جداسازی کرد.
روش تهیه بافر لیزکننده گلبول قرمز به شرح زیر است:
- ابتدا ۳۳۱ گرم NH4Cl و ۴۰ گرم KHCO3 را در ۶/۱ لیتر آب دوبار تقطیر حل می کنیم.
- سپس بر روی هیتر ۸/۱۴ گرم EDTA را اضافه کرده تا با گرما در آب حل گردد.
- سپس PH را با NaOH (5M) به ۴/۷ رسانده و در آخر با آب دو بار تقطیر حجم محلول را به ۲ لیتر می رسانیم و بعد محلول را اتوکلاو می کنیم.
- این محلول را به عنوان بافر لیزکننده گلبول قرمز x20 نگه داری می کنیم و هنگام استفاده، آن را با آب دو بار تقطیر به نسبت 1:20 تقسیم می کنیم.
روش تهیه هیدروکسید سدیم
هیدروکسید سدیم یک ترکیب شیمیایی با فرمول NaOH است که به عنوان یک باز قوی در آزمایشگاه و صنعت کاربرد دارد. این ترکیب به صورت پرک، دانه ای، بلوک یا محلول مایع عرضه می شود.
برای تهیه NaOH، روش های مختلفی وجود دارد که برخی از آن ها عبارتند از:
- الکترولیز محلول سدیم کلرید: این روش بر پایه این اصل است که وقتی جریان الکتریکی از طریق یک محلول سدیم کلرید NaCl گذرانده شود، سدیم کلرید به هیدروژن H2، کلر Cl2 و هیدروکسید سدیم NaOH تجزیه می شود. این روش برای تولید NaOH در مقیاس صنعتی استفاده می شود.
- فرایند سودا-آهک: این روش بر پایه این اصل است که وقتی کربنات سدیم Na2CO3) با آهک خام CaO و آب H2O در دمای بالا واکنش داده شود، هیدروکسید سدیم NaOH و کربنات کلسیمCaCO3 تولید می شود. این روش برای تولید NaOH در قبل از الکترولیز استفاده می شد.
شما عزیزان میتوانید بر داشتن اطلاعات بیشتر و خرید دستگاه ترمال سایکلر و همچنین برای مشاوره تست های مولکولی و خرید مواد مولکولی با کارشناسان ما در شرکت مانا تک در تماس باشید.
