سبد خرید شما

برای شما

پشتیبانی

تماس با پشتیبانی

شبکه های مجازی

  • اینستاگرام
  • تلگرام
  • ایتا

توالی یابی سنگر (Sanger Sequencing)

توالی یابی

توالی یابی یک روش برای تعیین ترتیب نوکلئوتیدهای DNA یا RNA است که اطلاعات ژنتیکی را رمز می کنند. توالی یابی می تواند برای شناسایی و مقایسه ژن ها، پروتئین ها، موجودات زنده و بیماری های ژنتیکی و عفونی مورد استفاده قرار گیرد.

تاریخچه توالی یابی

تاریخچه توالی یابی به سال ۱۹۵۳ بر می گردد که جیمز واتسون و فرانسیس کریک ساختار مارپیچ دوگانه DNA را کشف کردند. از آن زمان به بعد، روش های مختلف و پیشرفته تری برای تعیین توالی DNA و RNA طراحی و ابداع شده اند.

روش های متفاوت توالی یابی

  • روش ماکسام-گلبرت:

این روش در سال ۱۹۷۶ توسط آلن ماکسام و والتر گیلبرت ابداع شد و بر اساس تغییر و برش شیمیایی DNA در بازهای خاص کار می کند. این روش در ابتدا محبوب تر از روش سنگر بود، چون اجازه می داد از DNA استخراج شده به صورت مستقیم استفاده کنند، اما با پیشرفت روش سنگر و نسل بعدی توالی یابی، کاربرد آن کمتر شد.

این روش شامل چهار مرحله است:

  • اول، مولکول DNA تک رشته ای دناتوره می شود و سپس در انتهای ۵’ آن با فسفر ۳۲، یک ایزوتوپ رادیواکتیو، برچسب گذاری می شود.
  • دوم، DNA با پیپریدین و دو عامل شیمیایی دیگر که به پورین ها و پیریمیدین های مولکول DNA حمله می کنند، بریده می شود. این عامل های شیمیایی باعث می شود که مولکول DNA در یکی از چهار باز: آدنین، تیمین، گوانین و سیتوزین شکسته شود. با قرار دادن چهار لوله آزمایش برای هر عامل شیمیایی، چهار نمونه از قطعات با برش های یکسان به دست می آید.
  • سوم، هر چهار نمونه با الکتروفورز روی ژل پلی آکريل آمید جداسازی می شود و با استفاده از برچسب های رادیواکتیو، قطعات مختلف تفکیک می شود.
  • چهارم، برای خواندن توالي يابي DNA، لازم است از کوچکترین قطعه در پایین ژل شروع کرد.

روش سنگر:

در این روش، DNA را با استفاده از آنزیم DNA پلیمراز و نوکلئوتیدهای خاتمه زنجیره (ddNTPs) کپی می کنند. این نوکلئوتیدها باعث متوقف شدن رشد زنجیره دی ان ای در نقاط مختلف می شوند و زنجیره های کوتاه با طول های مختلف تولید می کنند. سپس، با استفاده از ژل الکتروفورز، زنجیره های DNA را براساس طول جدا می کنند و با استفاده از رادیواکتیو یا فلورسانس، ترتیب نوکلئوتیدهای آخر هر زنجیره را مشخص می کنند.

فرایند توالی‌یابی سانگر:

در رویکرد توالی‌یابی سانگر، DNA تقویت‌شده یا DNA مکمل (cDNA) به یک آغازگر الیگونوکلئوتیدی متصل می‌شود و سپس توسط آنزیم DNA پلیمراز گسترش می‌یابد که ترکیبی از 4 تری فسفات دئوکسی‌نوکلئوتید: dNTPs  dATP)، dGTP، dCTP،(dTTP  یا دی داکسی نوکلئوتید تری فسفات پایان دهنده زنجیرهddNTPs): ddATP ، ddGTP، ddCTP،ddTTP ) گنجاندن غلظت‌های محدودکننده سرعت ddNTP ‌ها، واکنش ازدیاد طول را متوقف می‌کند، زیرا ddNTPs ترکیب می‌شوند و در نتیجه قطعات DNA قابل تشخیص با طول‌های مختلف ایجاد می‌شود.

فرایند توالی یابی سنگر فعلی عموماً از تولید توالی های NA تا 800-1000 جفت باز پشتیبانی می کند. به طور معمول، مهم‌ترین محدودیت‌های این رویکرد، توالی‌های با کیفیت پایین در 15 تا 40 جفت باز اول به دلیل اتصال پرایمر، و ناتوانی در تشخیص تفاوت‌های تک جفت باز در بخش‌های طولانی‌تر هستند (به عنوان مثال، بیش از 900 جفت باز). توجه به این محدودیت ها، چه تجاری و چه غیرتجاری نرم افزار تجزیه و تحلیل توالی به تکامل خود ادامه می دهد تا به کاربر کمک کند تا داده های با کیفیت پایین را به طور خودکار ارزیابی و برش دهد.

فرایند توالی‌یابی سنگر به صورت زیر انجام می‌شود:

  1. آماده‌سازی DNA: ابتدا نمونه DNA مورد نظر به صورت کمی پرتابل شده و آماده می‌شود. سپس نمونه DNA به تعداد زیادی کپی (کلون) می‌شود.
  2. تهیه پرایمر: دو پرایمر که با دو سمت مخالف از توالی مورد نظر هماهنگ هستند، آماده می‌شوند. این پرایمرها به  DNAمتصل می‌شوند و به عنوان نقطه شروع برای سنتز DNA جدید استفاده می‌شوند.
  3. توالی‌یابی: در این مرحله، تکنیک DNA پلیمراز (DNA polymerase) با استفاده از DNA نوکلئوتیدهایی را به پرایمرها اضافه می‌کند. اگر نوکلئوتید جدید به پرایمر متصل شود، یک ریکشن شیمیایی رخ می‌دهد که باعث انتشار نور می‌شود.
  4. جدا سازی نوکلئوتیدها: نوکلئوتیدها که به دی‌دی‌ان‌ای اضافه شده‌اند، جدا می‌شوند و میزان نوری که از آنها انتشار یافته است، اندازه‌گیری می‌شود.
  5. تحلیل داده: نوکلئوتیدهای اضافه شده به هر پرایمر به ترتیب خوانده می‌شوند. این توالی‌ها به کمک نرم‌افزارهای مخصوصی تحلیل می‌شوند و توالی نهایی DNA به دست می‌آید.

توالی یابی سنگر از اهمیت بالایی برخوردار است چرا که امکان توالی‌یابی DNA را به طور دقیق فراهم می‌کند. این روش برای مطالعات ژنتیکی پایه و پیشرفته، تاریخ‌نگاری ژنومی، پژوهش‌های بیوانفورماتیکی و تشخیص اختلالات ژنتیکی استفاده می‌شود.

این روش دارای مزایا و معایب زیر است:

مزایا

بیشتر بخوانید:دستگاه دیجیتال pcr

  • دقت بالا در تعیین توالی DNA
  • قابل استفاده بودن برای نمونه های کم حجم و کم کیفیت
  • قابل استفاده بودن برای تایید نتایج توالی یابی نسل بعد (NGS)
  • قابل استفاده بودن برای تعیین توالی پلاسمید، جهش، درج و حذف

معایب:

  • سرعت پایین و هزینه بالا در مقایسه با NGS
  • نمونه گیری و پروسسینگ پیچیده و زمانبر
  • ناتوان در تعیین توالی ناحیه های پرتکرار و GC-rich
  • ناتوان در تعیین تغییرات ساختار ژنوم
  • روش توالی یابی نسل بعدی (NGS)

روش توالی‌یابی نسل بعدی یا NGS (Next Generation Sequencing) یک تکنولوژی پیشرفته در زمینه بیولوژی مولکولی است که به دقت بسیار بالا توالی DNA و RNA را می‌خواند. در مقایسه با روش‌های سنتی توالی‌یابی مانند روش سنگر، NGS قادر به همزمان توالی‌یابی میلیون‌ها قطعه DNA مختلف در یک زمان است. این تکنیک با امکانات بالای توالی‌یابی و تحلیل داده‌ها، اطلاعات زیستی بسیار جزئی و جامعی از ساختار ژنوم هر ارگان فراهم می‌کند.

یکی از ویژگی‌های بارز NGS توانایی انجام توالی‌یابی با سرعت بالا و هزینه کمتر نسبت به روش‌های قدیمی است. این امکان به محققان اجازه می‌دهد تا تغییرات ژنومی مرتبط با بیماری‌ها، تکامل و سایر فرایندهای زیستی را با دقت بیشتری بررسی کنند. همچنین، NGS در تحقیقات بیولوژی سلولی و مولکولی، زیست‌اطلاعاتی، مطالعات تکاملی و جدیدترین شاخه‌های پزشکی از جمله پزشکی شخصی (پزشکی دقیق) بسیار مؤثر است. این تکنولوژی امکانات مهمی برای تحقیقات داروسازی، توالی‌یابی RNA و تحلیل ژن‌های انفرادی را نیز فراهم می‌کند.

روش های NGS چندین مزیت دارند:

  • سرعت: این روش ها قادر هستند در زمان کم، حجم زیادی از DNA را توالي يابي كنند. برای مثال، چندین ساعت برای تولید گیگابایت ها از داده های توالي يابي.
  • دقت: این روش ها قادر هستند با استفاده از الگوریتم های پردازش سیگنال و تصحیح خطا، خطاهای ناشی از نامطلوبات فن آوری را کاهش دهند و دقت بالایی در خواندن بازهای DNA داشته باشند.
  • گستردگی: این روش ها قادر هستند با استفاده از روش های نمونه برداری و غنی سازی، DNA های با منشأ و ساختار مختلف را تولید و تحليل كنند. برای مثال: DNA ژنوم، DNA محصول، RNA کپسید شده و غیره.

اما این روش ها چندین محدودیت هم دارند:

  • هزینه: این روش ها نسبت به روش توالی یابی سنگر هزینه بیشتری دارند و نیاز به تجهیزات و مواد شیمیایی پیچیده و گران قیمت دارند.
  • پیچیدگی: این روش ها نسبت به روش توالی یابی سنگر پیچیده تر هستند و نیاز به دانش و مهارت فنی بالایی دارند. همچنین نیاز به استفاده از نرم افزارهای تحليل داده های توالي يابي با ظرفيت و قابليت بالا دارند.
  • نامطمئن: این روش ها ممکن است با بعضی از ساختارهای DNA مانند تکرارهای تاندم، حلقه های دای سولفید و DNA های متصل شده به پروتئین مشکل داشته باشند و نتایج ناقص یا اشتباهی را تولید کنند.
  • روش توالی یابی نانوپور:

توالی یابی نانوپور یک روش نسل سوم توالی یابی DNA یا RNA است که بدون نیاز به تقویت PCR یا برچسب زدن شیمیایی، میتواند توالی یک مولکول واحد را تعیین کند. این روش از چگالی جریان الکتریکی در سراسر یک ساختار نانوپور برای شناسایی تغییرات میدان الکتریکی به دلیل ورود نوکلئوتیدهای مختلف به درون آن استفاده میکند. این روش دارای پتانسیل ارائه ژنوتیپ کم هزینه، تحرک زیاد، پردازش سریع و نمایش نتایج در زمان واقعی است. این روش در شناسایی سریع پاتوژن های ویروسی، نظارت بر محیط زیست، توالی ژنوم انسان و گیاه، مانیتورینگ مقاومت آنتی بیوتیک و برنامه های دیگر کاربرد دارد.

مقایسه تکنیک Sanger با روش های NGS:

این دو روش در اصول، سرعت، دقت، هزینه و کاربردهای خود با هم تفاوت دارند. به طور خلاصه می توان گفت:

  • تکنیک Sanger بر اساس استفاده از نوکلئوتیدهای دیدئوکسی (ddNTP) که باعث متوقف شدن سنتز DNA می شوند، کار می کند. سپس زنجیره های تولید شده با الکتروفورز ژل جداسازی و با استفاده از رادیواکتیویته یا فلورسانس شناسایی می شوند. این روش برای توالی یابی قطعات بلند و مجزای DNA مناسب است، اما برای پروژه های بزرگتر و پیچیده تر مانند توالی یابی کل ژنوم یا متاژنوم کارآمد و اقتصادی نیست.
  • روش های NGS قادر هستند با استفاده از فن آوری های پیشرفته، هزاران تا میلیون ها قطعه DNA را به صورت همزمان و با سرعت و دقت بالا توالي يابي كنند. این روش ها به دو دسته اصلی تقسيم مي شوند: توالي يابي جريان خروجي (SBS) و توالي يابي جريان ورودي (SIS). در روش SBS، قطعات DNA به صورت تک رشته اي به يك سطح ثابت (چيپ) متصل مي شوند و با استفاده از نور فلورسانس، بازهاي آنها خوانده مي شود. در روش SIS، قطعات DNA به صورت دو رشته اي به يك سطح حساس به الكتروفورز (پور) متصل مي شود و با استفاده از جريان الكتريكي، بازهاي آنها خوانده مي شود. این روش ها برای تولید و تحليل حجم زیادی از داده های توالي يابي مناسب هستند، اما نسبت به روش Sanger پیچیده تر و گران قیمت تر هستند.

مقایسه توالی یابی سنگر و نانوپور:

در توالی یابی نانوپور، از ddNTP استفاده نمی شود. در توالی یابی سنگر، ddNTP ها باعث متوقف شدن واکنش پلیمریزاسیون DNA می شوند و نقش برچسب را برای تشخیص توالی بازها دارند. اما در توالی یابی نانوپور، هیچ برچسب شیمیایی یا PCR لازم نیست. در این روش، فقط یک مولکول DNA یا RNA به صورت تک رشته از طریق یک سوراخ کوچک به نام نانوپور عبور می کند و باعث تغییر جریان الکتریکی در آن می شود. این جریان الکتریکی بسته به نوع نوکلئوتید که در حال عبور است، متفاوت است و می توان با تجزیه و تحلیل آن، توالی مولکول را بدست آورد.

کلام آخر:

در این مقاله، برای شما تکنیک توالی یابی سنگر توضیح داده شد و با سایر تکنیک های توالی یابی مقایسه شد. برای دریافت خدمات تخصصی مولکولی و خرید انواع دستگاه ترمال سایکلر PCR با کارشناسان مجرب ما در ماناتک تماس حاصل فرمایید.

0 0 رای ها
امتیازدهی به مقاله
اشتراک در
اطلاع از
guest
0 نظرات
بازخورد (Feedback) های اینلاین
مشاهده همه دیدگاه ها