تکنیک مولکولی MLPA

aMLPA معرفی تکنیک و اصول کاری

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) یک تکنیک مولکولی است که برای تشخیص تغییرات تعداد کپی‌های DNA (CNVs) به کار می‌رود. این روش به خصوص برای شناسایی دوبرابر شدن‌ها یا حذف‌های توالی‌های DNA که برای تشخیص اختلالات ژنتیکی، برخی سرطان‌ها و ناهنجاری‌های کروموزومی بسیار مهم هستند، بسیار مفید است.  تکنیک MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) یک روش بیومولکولی پیشرفته است که برای تشخیص تغییرات تعداد کپی‌های DNA در یک ژنوم استفاده می‌شود. این روش به ویژه برای بررسی اختلالات ژنتیکی که در آن‌ها تغییرات در تعداد کپی‌های ژن‌ها اهمیت دارند، مفید است. MLPA با استفاده از مجموعه‌ای از پروب‌های DNA که هر کدام شامل دو نیمه مجزا هستند، کار می‌کند. این دو نیمه تنها در صورت قرار گرفتن در کنار یک توالی هدف خاص در نمونه DNA به یکدیگر متصل و سپس تکثیر می‌شوند. این فرایند به تعیین تعداد کپی‌های موجود در نمونه کمک می‌کند.

کاربردهای تشخیصی MLPA

MLPA در تشخیص بسیاری از بیماری‌های ژنتیکی کاربرد دارد، به خصوص آن‌ها که شامل حذف‌ها یا دوبل‌شدگی‌های کوچک در ژن‌ها هستند. این بیماری‌ها شامل: دیستروفی عضلانی دوشن: این بیماری که از طریق حذف یا تغییرات در ژن DMD ایجاد می‌شود، با استفاده از MLPA برای تشخیص دقیق تغییرات تعداد کپی‌ها بررسی می‌شود. سندرم دی جرج (22q11.2 deletion syndrome): این سندرم که با حذف قسمتی از کروموزوم 22 مشخص می‌شود، می‌تواند با MLPA تشخیص داده شود. سرطان‌های مختلف: تغییرات تعداد کپی در ژن‌های خاص می‌تواند به تشخیص و درمان برخی سرطان‌ها کمک کند.

مراحل

پروب‌های هدف‌مند: MLPA از مجموعه‌ای از پروب‌ها استفاده می‌کند که به توالی‌های خاصی از DNA علاقه‌مند هستند. هر پروب از دو نیمه تشکیل شده است که می‌توانند به طور مجاور به توالی هدف DNA بچسبند. لیگاسیون و تکثیر: پس از هیبرید شدن پروب‌ها به DNA هدف، اگر به درستی روی رشته DNA قرار گرفته باشند، به هم متصل (لیگاته) می‌شوند. این رویداد لیگاسیون بسیار مهم است زیرا فقط پروب‌های لیگاته در مراحل بعدی تکثیر می‌شوند. قابلیت چندگانگی: MLPA می‌تواند چندین توالی DNA را به طور همزمان در یک واکنش تحلیل کند، که این امر آن را به یک تکنیک بسیار کارآمد برای غربالگری در مقیاس بزرگ تبدیل می‌کند.

مزایا

• حساسیت و اختصاصیت: MLPA بسیار حساس است و حتی تغییرات تک‌کپی در تعداد ژن‌ها را تشخیص می‌دهد.
• کارآمد برای تعداد زیادی از نمونه‌ها: این روش برای غربالگری با توان بالا مناسب است و امکان پردازش همزمان بسیاری از نمونه‌ها را فراهم می‌کند.
• صرفه‌جویی در هزینه: در مقایسه با برخی روش‌های دیگر مانند آرایه CGH، MLPA برای تست تعداد محدودی از لوکوس‌های ژنتیکی از نظر هزینه مؤثرتر است.

محدودیت‌ها

• محدود شده توسط طراحی پروب: دامنه تغییرات ژنتیکی قابل تشخیص به نواحی‌ای که برای آنها پروب‌ها طراحی شده‌اند محدود است.
• محدودیت تجزیه و تحلیل کمی: در حالی که MLPA برای تشخیص وجود یا عدم وجود تغییرات تعداد کپی عالی است، در تعیین دقیق تعداد کپی‌ها کمتر دقیق است.
• نیاز به تجهیزات تخصصی: این تکنیک نیاز به تجهیزات تخصصی برای الکتروفورز کاپیلاری و پرسنل ماهر برای تفسیر دقیق نتایج دارد

مراحل و زمان بندی روش MLPA

توجه داشته باشید که این زمانها میتوانند بر اساس کیتهای خاص MLPA و دستورالعملهای تولیدکننده کمی متفاوت باشند. استخراج DNA: مدت زمان: 30 دقیقه تا چند ساعت- DNA از نمونه های بیولوژیکی استخراج میشود. زمان لازم برای این مرحله به روش استخراج و نوع نمونه بستگی دارد. دناتوراسیون DNA: مدت زمان: 5 دقیقه–  DNA استخراج شده در دمای بالا (معمولاً حدود 95 درجه سلسیوس) قرار داده میشود تا دو رشته آن از هم جدا شوند. هیبریداسیون پروب: مدت زمان: 16-20 ساعت (معمولاً شبانه) – پروب های MLPA به رشته های تکی DNA در دمای پایینتر (حدود 60 درجه سلسیوس) هیبرید میشوند. این مرحله معمولاً شبانه انجام میشود تا زمان کافی برای هیبریداسیون فراهم شود. لیگاسیون: مدت زمان: 15 دقیقه تا 1 ساعت- پروب های هیبرید شده توسط آنزیم لیگاز به یکدیگر متصل میشوند. این مرحله در دمای کمتر (حدود 54 درجه سلسیوس) انجام میشود. PCR: مدت زمان: 2-3 ساعت– پروب های لیگه شده توسط PCR تکثیر میشوند. این مرحله شامل چندین چرخه حرارتی است که شامل دناتوراسیون، هیبریداسیون پرایمر و اکستنشن است. تجزیه و تحلیل: مدت زمان: 1-2 ساعت– محصولات PCR توسط روشهایی مانند الکتروفورز ژل یا سکوئنسینگ مورد تجزیه و تحلیل قرار میگیرند. این مرحله به تشخیص وجود یا عدم وجود تغییرات در تعداد کپی های ژنها کمک میکند.

برای انجام تست MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)، چندین دستگاه و ابزار آزمایشگاهی کلیدی نیاز است. در اینجا به برخی از مناسب ترین و متداول ترین دستگاههای مورد استفاده برای هر مرحله اشاره میکنم:

2. دستگاه استخراج DNA– دستگاه های رایج: دستگاه هایی مانند QIAcube (QIAGEN) یا KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) که امکان استخراج خودکار DNA را فراهم میکنند.
3. ترموسایکلر– دستگاه های رایج: ترموسایکلرهایی مانند (Applied Biosystems)96 veriti یا C1000 Touch (Bio-Rad) که دقت حرارتی بالایی دارند و برنامه ریزی چرخه های حرارتی مختلف را امکانپذیر میکنند.

4. دستگاه الکتروفورز – دستگاه های رایج: دستگاه های الکتروفورز ژل مانند Gel Doc (Bio-Rad) یا systems from Invitrogen که امکان تجزیه و تحلیل دقیق نمونه ها را فراهم میکنند.
5. دستگاه کپیلاری الکتروفورز یا سکوئنسر– دستگاه های رایج: دستگاه هایی مانند ABI Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) یا QIAxcel (QIAGEN) که امکان تجزیه و تحلیل دقیقتری را نسبت به الکتروفورز ژل ساده فراهم میکنند.

الزامات کلیدی برای دستگاه‌های PCR در MLPA

• توانایی‌های سیکلر حرارتی: تجهیزات اصلی مورد نیاز برای MLPA یک سیکلر حرارتی است که یک دستگاه استاندارد در آزمایشگاه‌های بیولوژی مولکولی است. این دستگاه باید قادر به کنترل دقیق چرخه‌های دمایی مورد نیاز برای PCR باشد.
• پروفایل‌های دمایی قابل برنامه‌ریزی: سیکلر حرارتی باید امکان برنامه‌ریزی پروفایل‌های دمایی خاص را فراهم کند. مراحل مختلف MLPA مانند دناتوره شدن، آنیلینگ و اکستنشن، به دماهای مختلفی نیاز دارند و دستگاه باید قادر به تغییر دقیق و سریع بین این دماها باشد.
• توزیع یکنواخت دما: حفظ دمای یکنواخت در تمامی چاهک های نمونه برای دستگاه PCR ضروری است تا اطمینان حاصل شود که تکثیر در تمام نمونه‌ها به طور یکسان انجام می‌شود.
• ظرفیت نمونه: دستگاه باید قادر به جای دادن تعداد نمونه‌هایی باشد که برنامه‌ریزی کرده‌اید. سیکلرهای حرارتی با ظرفیت‌های متفاوتی وجود دارند، از چند تا چند صد چاه.
• سازگاری با حجم واکنش‌ها: واکنش‌های MLPA ممکن است به حجم‌های خاصی نیاز داشته باشند و سیکلر حرارتی باید با این تنظیمات واکنش، که معمولاً شامل حجم‌های کوچک است، سازگار باشد.

الزامات پس از PCR: به یاد داشته باشید، MLPA همچنین نیاز به تجزیه و تحلیل پس از PCR دارد که معمولاً شامل الکتروفورز مویرگی است. این مرحله برای تجزیه و تحلیل محصولات تقویت شده بسیار مهم است و معمولاً با استفاده از تجهیزات تخصصی، اغلب جدا از دستگاه PCR انجام می شود.

برای مطالعه بیشتر به مقاله ذیل مراجعه فرمایید.

این مقاله از تکنیک MLPA در کنار نسل جدید تعیین توالی (NGS) برای تشخیص بیماری‌های دیستروفی عضلانی دوشن و آتروفی عضلانی نخاعی استفاده کرده است.

بیشتر بخوانید:تکثیر مبتنی بر تهاجم رشته‌ای (SIBA)+ Strand Invasion Based Amplification

لینک دانلود مقاله

کلام آخر

به طور خلاصه، MLPA الزامات خاصی برای هیبریداسیون و پروب دارد، مرحله PCR را می توان با استفاده از چرخه های حرارتی استاندارد موجود در اکثر آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی انجام داد، مشروط بر اینکه معیارهای کنترل دما و قابلیت برنامه ریزی چرخه را داشته باشند. چندین تولید کننده تجهیزات مولکولی از جمله PCR وجود دارد که از جمله آنها می توان به کمپانی های بزرگ و معتبر Thermo Fisher Scientific، Bio-Rad و Eppendorf اشاره کرد. مدل ها از نظر ظرفیت، دقت و ویژگی های اضافی متفاوت هستند. برای MLPA، یک سیکلر حرارتی استاندارد از هر سازنده معتبر کافی است، تا زمانی که الزامات اساسی ذکر شده در بالا را برآورده کند. برای اطلاعات بیشتر میتوانید با کارشناسان ما در شرکت ماناتک در تماس باشید.