ریل تایم PCR که qPCR هم نامیده میشود، این واژه از quantitative به معنای کمی گرفته شده است. طبق قرارداد ها اگر قرار است در مقالات از ریل تایم PCR نام ببریم بهتر است از qpcr استفاده شود. یکی از مزایای این تکنیک، قابلیت مانیتورینگ لحظه به لحظه واکنش است و به همین سبب، نام ریل تایم یا زمان واقعی به این تکنیک داده شده است. این امر باعث بهینهسازی واکنش و تعیین مناسبترین غلظت DNA و پرایمر و همچنین تعداد سیکل لازم برای تکثیر میشود. همچنین، این تکنیک برای بررسی بیان ژنها، ارزیابی اثر داروی مورد نظر بر تغییرات بیان ژن، بررسی میزان بیان آنزیمهای کبدی برای متابولیز کردن داروی خاص، ژن درمانی، شناسایی و تعیین Load عوامل عفونی، بررسی سرطانهای خونی و تعیین ریسک بازگشت آن و تعیین میزان موفقیت پیوند اعضاء به کار میرود.
ریل تایم PCR یا واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی یکی از روشهای پیشرفته برای تکثیر و شناسایی DNA یا RNA بهصورت کمی و کیفی است. این تکنیک از اصول اولیه PCR استفاده میکند اما با یک تفاوت اساسی: امکان مشاهده و اندازهگیری میزان محصول تکثیرشده در هر چرخه، بهصورت همزمان و در لحظه وجود دارد.
این روش بر اساس استفاده از رنگهای فلورسانت یا پروبهای خاص عمل میکند. در طول چرخههای تکثیر، این رنگها یا پروبها با محصول تکثیر واکنش نشان داده و نور فلورسانت تولید میکنند. شدت این نور به میزان DNA تکثیرشده در هر لحظه بستگی دارد و توسط دستگاهی به نام ترموسایکلر ریل تایم اندازهگیری میشود. اطلاعات مربوط به شدت فلورسانس در طول چرخههای PCR بهصورت گرافیکی نمایش داده میشود که این دادهها برای تجزیه و تحلیل نتایج کمی و کیفی استفاده میشوند.
ریل تایم PCR دارای دو نوع کلی است: روش مبتنی بر رنگهای اتصالیافته به DNA دو رشتهای مانند SYBR Green و روش مبتنی بر پروبهای اختصاصی مانند TaqMan. در روش اول، رنگ فقط به DNA دو رشتهای متصل میشود و شدت فلورسانس افزایش مییابد. این روش سادهتر و کمهزینهتر است، اما ممکن است به دلیل تکثیر غیراختصاصی نتایج دقیقتری ارائه ندهد. روش دوم از پروبهای دارای گزارشگر و خاموشکننده استفاده میکند که تنها در حضور توالی هدف فلورسانس تولید میکنند، بنابراین دقت و اختصاصیت بالاتری دارد.
کاربردهای ریل تایم PCR شامل تشخیص بیماریهای عفونی، بررسی بیان ژن، جهشهای ژنتیکی، و آنالیز کمی DNA یا RNA است. در تشخیصهای بالینی، این روش بهدلیل سرعت، دقت بالا، و حساسیت فوقالعاده، بهویژه در شناسایی ویروسها و بیماریهای ژنتیکی، بسیار ارزشمند است. همچنین این تکنیک در تحقیقات ژنتیکی و مطالعات زیستمولکولی بهطور گستردهای استفاده میشود.
تکنیکی که علاوه بر بررسی وجود یا عدم وجود یک پاتوژن بلکه به ما میگوید که چه میزان copy number از پاتوژن در نمونه های مختلف وجود دارد. در Real-time PCR، منحنی میزان تکثیر محصول در هر سیکل PCR ترسیم میشود و این منحنی شامل سه فاز میباشد که به ترتیب شامل فاز Baseline region یا Linear phase، فازهای Exponential phase و فاز plateau phase است. در فاز Baseline region، میزان تکثیر محصولات به قدری نیست که سبب افزایش نور فلورسنت گردد. در فاز Exponential phase، میزان محصول دو رشتهای در هر چرخه دو برابر میشود بنابراین میزان محصولات به صورت نمایی افزایش مییابد. در فاز Plateau phase، ترکیبات واکنش از بین میروند و دیگر محصولی تکثیر نمیشود بنابراین افزایشی در میزان فلورسنت مشاهده نمیشود.
دستگاههای ریل تایم PCR برای انجام این تکنیک، ترکیبی از عملکردهای یک ترموسایکلر استاندارد و سیستمهای نوری پیشرفته هستند. این دستگاهها قادرند تغییرات فلورسانت را در زمان واقعی ثبت کنند و دادهها را برای تحلیل دقیق خروجیهای کمی و کیفی ارائه دهند. دادههای بهدستآمده معمولاً بهصورت نمودارهایی نمایش داده میشوند که محور افقی تعداد چرخههای PCR و محور عمودی شدت فلورسانس است. این نمودارها به محققان کمک میکنند تا نقطه چرخه آستانه (Ct یا Threshold Cycle) را شناسایی کنند. این نقطه زمانی است که فلورسانس از پسزمینه بیشتر میشود و مستقیماً به غلظت اولیه ماده هدف مرتبط است.
یکی از مزایای مهم ریل تایم PCR، کاهش زمان لازم برای انجام آزمایش است، زیرا نیازی به انجام ژلالکتروفورز برای بررسی محصول PCR وجود ندارد. علاوه بر این، این تکنیک بسیار حساس است و قادر به تشخیص مقادیر بسیار کم DNA یا RNA میباشد. از سوی دیگر، دقت بالا و توانایی تفکیک توالیهای ژنتیکی مشابه اما متفاوت نیز از دیگر مزایای این روش است.
ریل تایم PCR همچنین بهعنوان یک ابزار استاندارد در شناسایی و پایش عفونتها مانند HIV، هپاتیت B و C، و SARS-CoV-2 استفاده میشود. در زمینه انکولوژی، این روش برای شناسایی جهشهای ژنی مرتبط با سرطان یا بررسی بیان ژنهای خاص در سلولهای سرطانی به کار میرود. در صنایع غذایی، از ریل تایم PCR برای تشخیص آلودگی میکروبی یا تعیین اصالت محصولات استفاده میشود.
در تکنیکهای پیشرفتهتر، مانند دیجیتال PCR، از اصول مشابهی استفاده میشود اما با دقت و حساسیت بسیار بالاتر. با این حال، ریل تایم PCR همچنان به دلیل سرعت و مقرونبهصرفه بودن، بهویژه در آزمایشگاههای تشخیصی و تحقیقاتی، محبوبیت گستردهای دارد.
در ادامه باید به چالشها و بهبودهایی که در طول سالها در تکنیک ریل تایم PCR ایجاد شده اشاره کنیم. یکی از مهمترین مسائل اولیه این روش، احتمال ایجاد نتایج غیراختصاصی بود، بهویژه در روشهایی که از رنگهای عمومی مانند SYBR Green استفاده میکنند. برای رفع این مشکل، پروبهای اختصاصی مانند TaqMan طراحی شدند که فقط به توالی هدف متصل میشوند و با حذف فلورسانسهای غیراختصاصی، نتایج دقیقتری ارائه میدهند.
همچنین، طراحی پرایمرها و پروبها نقش کلیدی در موفقیت این تکنیک دارد. انتخاب توالیهای مناسب باید با دقت انجام شود تا از تکثیر غیراختصاصی جلوگیری شود. نرمافزارهای پیشرفته طراحی پرایمر و پروبها، مانند Primer-BLAST، در این زمینه کمک بزرگی به محققان کردهاند. این نرمافزارها با تجزیه و تحلیل توالیهای ژنتیکی و پیشبینی ساختارهای دوم DNA از ایجاد خطا جلوگیری میکنند.
یکی دیگر از بهبودهای اخیر در ریل تایم PCR، استفاده از چندرنگی (Multiplex PCR) است که امکان شناسایی همزمان چندین توالی هدف در یک واکنش را فراهم میکند. در این روش، از پروبهای فلورسانت با طولموجهای مختلف برای هر توالی هدف استفاده میشود. این قابلیت در تشخیص همزمان عفونتهای مختلف یا جهشهای ژنی متعدد اهمیت بالایی دارد.
ریل تایم PCR همچنین در حوزه تحقیقات اپیژنتیک نقش مهمی ایفا کرده است. برای مثال، بررسی متیلاسیون DNA، که یک علامت اپیژنتیکی کلیدی در بسیاری از بیماریها است، با استفاده از پروبهای خاص و مواد شیمیایی بهینه شده انجام میشود. این پیشرفتها باعث شده است که این تکنیک به ابزاری بسیار قدرتمند برای درک تنظیمات ژنتیکی و اپیژنتیکی تبدیل شود.
در کاربردهای بالینی، کیتهای تجاری آماده برای ریل تایم PCR بهطور گسترده در دسترس هستند و فرآیند آزمایش را سادهتر و سریعتر کردهاند. این کیتها شامل تمامی مواد مورد نیاز مانند پرایمرها، پروبها، و مواد شیمیایی بهینهسازی شدهاند و نیاز به تنظیمات پیچیده را کاهش دادهاند. شرکتهایی مانند Manatech Molecular با تولید کیتهای اختصاصی برای شناسایی بیماریهایی مانند HPV، توانستهاند دقت و کارایی این روش را بهطور چشمگیری افزایش دهند.
در نهایت، تکنیک ریل تایم PCR نهتنها ابزاری برای تکثیر و شناسایی DNA است، بلکه با ادغام آن در سیستمهای خودکار و استفاده از الگوریتمهای پیشرفته تحلیل داده، به یک پلتفرم کامل برای تشخیص مولکولی و تحقیقات ژنتیکی تبدیل شده است. این روند نشان میدهد که با ادامه نوآوریها، کاربردهای این تکنیک در آینده حتی گستردهتر خواهد شد.
پیشرفت در توسعه مواد شیمیایی، پروبهای فلورسانت و نرمافزارهای تجزیه و تحلیل دادهها باعث شده است که ریل تایم PCR روزبهروز کارآمدتر و کاربرپسندتر شود. این امر به افزایش قابلیت استفاده از این تکنیک در حوزههای مختلف از تشخیص پزشکی گرفته تا تحقیقات زیستمحیطی کمک کرده است.
شما میتوانید برای خرید دستگاه ریل تایم پی سی آر و همچنین برای ستاپ کردن برنامه مرود نظر خود در تست های خاص با شرکت مانا تک در تماس باشید. مشاوران ما شما را راهنمایی خواهند کرد.
چقدر این پست مفید بود؟
روی یک ستاره کلیک کنید تا به آن امتیاز دهید!
میانگین امتیاز 5 / 5. تعداد آرا: 1
تا الان رای نیامده! اولین نفری باشید که به این پست امتیاز می دهید.
سلام و درود به شما دوست گرامی. بله شرکت ما انواع تست های مولکولی را برای شما ستاپ میکند و نتیجه نهایی را به شما تحویل میدهد. برای گرفتن مشاوره در بخش ستاپ تست با کارشناسان ما در تماس باشید.
مقالات ماناتک
در این صفحه ما برای شما با عشق تولید محتوا می کنیم و سعی داریم برای شما بهترین محتوا را تولید کنیم.
عالی…
سپاس از نگاه شما
وقت بخیر
شما تست هم ستاپ میکنید؟
لطفا راهنمایی کنید
سلام و درود به شما دوست گرامی. بله شرکت ما انواع تست های مولکولی را برای شما ستاپ میکند و نتیجه نهایی را به شما تحویل میدهد. برای گرفتن مشاوره در بخش ستاپ تست با کارشناسان ما در تماس باشید.