CFDNA یا DNA آزاد جریان خون (cell-free DNA) یک نوع DNA است که در خارج از سلول ها در مایعات بدنی مانند خون، لنف، بزاق و غیره وجود دارد. CFDNA معمولاً از تجزیه سلول های مرده یا آسیب دیده ناشی می شود و دارای طول کوتاه (حدود ۱۵۰-۲۰۰ پیریمیدین) است. CFDNA می تواند حامل اطلاعات ژنتیکی در مورد سلول های منبع خود باشد و برای تشخیص و پیگیری برخی از بیماری ها، به ویژه سرطان و بارداری، کاربرد دارد.
برای تشخیص و پیگیری برخی از بیماری ها با استفاده از CFDNA، لازم است که CFDNA را از نمونه های خون یا مایعات بدنی دیگر استخراج و تحلیل کنید. بعد از استخراج و تحلیل CFDNA، می توانید با استفاده از روش های مختلف تشخیص پزشکی که در سایت Thermo Fisher Scientific معرفی شده اند، به بررسی و پیگیری برخی از بیماری ها بپردازید.
استخراج DNA آزاد سلولی (cfDNA) فرآیندی است که به منظور جداسازی و خالصسازی DNA کوتاه و آزاد موجود در پلاسما، سرم یا سایر مایعات بدن انجام میشود. cfDNA قطعات کوچکی از DNA است که معمولاً بین 150 تا 200 جفتباز طول دارند و به دلیل فرآیندهای طبیعی مانند آپوپتوز یا نکروز از سلولها آزاد شدهاند. این نوع DNA در بسیاری از کاربردهای تحقیقاتی و تشخیصی، از جمله تشخیص سرطان، بیماریهای ژنتیکی، و بررسیهای غیرتهاجمی پیش از تولد (NIPT) مورد استفاده قرار میگیرد.
فرآیند استخراج cfDNA معمولاً شامل مراحل زیر است:
۱. جمعآوری نمونه:
نمونه معمولاً از خون کامل گرفته میشود، اما میتواند از سایر مایعات بدن مانند مایع مغزی-نخاعی، ادرار یا بزاق نیز به دست آید. برای استخراج cfDNA از خون، معمولاً از لولههای مخصوص حاوی مواد ضد انعقاد مانند EDTA استفاده میشود تا از لخته شدن خون جلوگیری شود. همچنین لولههایی وجود دارند که با مواد تثبیتکننده cfDNA پوشش داده شدهاند و از تجزیه آن طی حملونقل یا نگهداری جلوگیری میکنند.
۲. جداسازی پلاسما یا سرم:
نمونه خون با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت بالا پردازش میشود تا پلاسما یا سرم از گلبولهای خون جدا شود. این مرحله بسیار مهم است، زیرا گلبولهای قرمز یا سفید ممکن است DNA سلولی آزاد کنند و با cfDNA تداخل ایجاد کنند. سانتریفیوژ معمولاً در دو مرحله انجام میشود: یک مرحله اولیه برای جدا کردن گلبولها و یک مرحله ثانویه با سرعت بالاتر برای حذف ذرات کوچکتر.
۳. لیز سلولی و آزادسازی cfDNA:
در این مرحله از محلولهای خاصی برای شکستن هرگونه ساختار سلولی باقیمانده و آزادسازی cfDNA استفاده میشود. این محلولها معمولاً شامل ترکیبات لیزکننده و پروتئیناز K برای تخریب پروتئینها و آزادسازی DNA هستند.
۴. جداسازی cfDNA از سایر ترکیبات:
این مرحله از روشهای خاصی برای خالصسازی cfDNA استفاده میکند. معمولترین روشها شامل استفاده از ستونهای سیلیکایی یا روشهای مبتنی بر ذرات مغناطیسی است.
- در روش ستونهای سیلیکایی، DNA با افزودن بافرهای مناسب به ستون متصل میشود و سپس با شستشو ناخالصیها حذف و در نهایت با استفاده از بافری مانند TE یا آب بدون نوکلئاز از ستون آزاد میشود.
- در روشهای مبتنی بر ذرات مغناطیسی، DNA به ذرات مغناطیسی متصل شده و با استفاده از میدان مغناطیسی جدا میشود. این روش بسیار سریع و کارآمد است و برای پردازش حجمهای بالای نمونه مناسب است.
۵. شستشو و خالصسازی نهایی:
در این مرحله، DNA با استفاده از محلولهای شستشو از هرگونه آلاینده باقیمانده مانند نمکها، پروتئینها و سایر مولکولهای مزاحم پاکسازی میشود. شستشوی کامل برای اطمینان از کیفیت بالای cfDNA ضروری است.
۶. بازیابی DNA:
پس از شستشو، cfDNA با استفاده از یک بافر الویشن یا آب بدون نوکلئاز از ستون یا ذرات مغناطیسی آزاد میشود. این مرحله باید با دقت انجام شود تا cfDNA به طور کامل بازیابی شود، زیرا حجم استخراجشده معمولاً کم است.
۷. ارزیابی کیفیت و کمیت:
برای اطمینان از موفقیت فرآیند استخراج، کیفیت و کمیت cfDNA استخراجشده باید ارزیابی شود. این کار معمولاً با استفاده از دستگاههایی مانند NanoDrop برای بررسی غلظت و خلوص یا دستگاههای مبتنی بر فلورسانس مانند Qubit برای اندازهگیری دقیقتر غلظت انجام میشود. همچنین، بررسی اندازه قطعات DNA با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز یا دستگاههایی مانند Bioanalyzer انجام میشود.
چالشها و نکات مهم:
استخراج cfDNA چالشهایی دارد که باید در نظر گرفته شود. یکی از این چالشها، غلظت پایین cfDNA در نمونهها است که نیازمند تکنیکهای حساس و دقیق است. همچنین جلوگیری از آلودگی نمونه با DNA سلولی یا سایر منابع خارجی اهمیت بالایی دارد. انتخاب کیتها و روشهای مناسب برای نوع نمونه و هدف آزمایش، نقش کلیدی در موفقیت استخراج دارد.
بهطور کلی، استخراج cfDNA یک فرآیند حساس است که نیازمند دقت بالا، تجهیزات پیشرفته و رعایت استانداردهای دقیق است تا نتایج قابل اعتماد و کاربردی حاصل شود.
پس از استخراج و ارزیابی کیفیت cfDNA، مرحله بعدی بسته به کاربرد مورد نظر تعیین میشود. از آنجایی که cfDNA معمولاً در مقادیر کم و با قطعات کوتاه وجود دارد، آمادهسازی دقیق و تحلیل مناسب از اهمیت زیادی برخوردار است.
کاربردهای cfDNA:
یکی از رایجترین کاربردهای cfDNA در تشخیص سرطان به عنوان بیومارکر تومور است. cfDNA که از سلولهای سرطانی آزاد میشود، به عنوان DNA تومور در گردش (ctDNA) شناخته میشود و میتواند اطلاعات ژنتیکی خاصی از تومور، مانند جهشها یا تغییرات اپیژنتیکی، فراهم کند. این اطلاعات به شناسایی نوع سرطان، پایش پاسخ به درمان، و حتی پیشبینی بازگشت بیماری کمک میکند.
cfDNA همچنین در آزمایشهای غیرتهاجمی پیش از تولد (NIPT) به کار میرود. در این کاربرد، cfDNA جنین که از جفت به جریان خون مادر منتقل میشود، برای شناسایی ناهنجاریهای ژنتیکی جنین، مانند سندرم داون یا تریزومیهای دیگر، مورد بررسی قرار میگیرد. این روش بسیار ایمنتر از روشهای تهاجمی مانند آمنیوسنتز است.
بیشتر بخوانید:تکنیک استخراج RNA از باکتری
در بیماریهای دیگر مانند بیماریهای خودایمنی، عفونتها و آسیبهای بافتی، cfDNA به عنوان یک شاخص زیستی میتواند سطح تخریب سلولی یا التهاب را نشان دهد. به عنوان مثال، در عفونتهای ویروسی، DNA ویروسی آزاد شده در پلاسما میتواند به طور مستقیم شناسایی شود.
برای اطلاعات بیشتر به لینک زیر مراجعه کنید
فهرست مطالب
?What is Cell-Free DNA
تحلیل cfDNA:
روشهای تحلیلی برای cfDNA اغلب نیازمند حساسیت و دقت بالایی هستند، زیرا غلظت cfDNA پایین و قطعات آن کوتاه است. تکنیکهای متداول شامل واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)، دیجیتال PCR (dPCR)، و توالییابی نسل جدید (NGS) هستند.
- PCR سنتی یا qPCR برای شناسایی جهشها یا تغییرات خاص استفاده میشود، اما به دلیل محدودیتهای آن در تحلیل همزمان چندین مکان ژنی، برای کاربردهای پیچیدهتر کافی نیست.
- دیجیتال PCR حساسیت بالاتری دارد و امکان شمارش دقیق مولکولهای cfDNA را فراهم میکند. این تکنیک برای شناسایی تغییرات ژنتیکی نادر بسیار مناسب است.
- NGS یک روش قدرتمند و جامع برای تجزیهوتحلیل کل ژنوم یا بخشهای خاصی از ژنوم است. این تکنیک میتواند تعداد زیادی از تغییرات ژنتیکی، شامل جهشها، حذفها، درجها و تغییرات اپیژنتیکی را شناسایی کند. با این حال، NGS پیچیدهتر و پرهزینهتر است.
تست NIPT
آزمایش NIPT یک آزمایش غربالگری نوین و پیشرفته است که با تجزیه و تحلیل DNA جنین که در خون مادر وجود دارد، می تواند خطر داشتن برخی از اختلالات کروموزومی را در جنین بررسی کند. این آزمایش دارای چندین مزیت نسبت به سایر آزمایشات غربالگری است که عبارتند از:
- مثبت کاذب کمتر: احتمال مثبت کاذب این آزمایش برای تریزومی های 21، 18 و 13 زیر یک درصد است، در حالی که در سایر آزمایشات غربالگری، این احتمال بین 3 تا 5 درصد است. این به معنی کاهش تعداد زنانی است که نیاز به آزمایشات تشخیصی تهاجمی دارند، که خطر سقط جنین را دارند.
- قدرت تشخیص بالاتر: بدلیل تفکیک DNA آزاد موجود در گردش خون مادر با منشاء جنینی (cffDNA) از DNA آزاد با منشاء مادری (cfmDNA) که در این روش انجام می گیرد، قدرت تشخیص به بالای 99 درصد برای اختلالات کروموزوم های 21، 18 و 13 می رسد، در حالی که در سایر آزمایشات غربالگری، قدرت تشخیص حدود 90 درصد است. این به معنی کاهش تعداد جنین های سالم که به عنوان مثبت کاذب شناسایی می شوند، است.
- صحت بالای تعیین جنسیت: قدرت آزمایش NIPT در تعیین جنسیت 97 درصد است، که در مقایسه با بسیاری از آزمایشات دیگر، بالاتر است. این به معنی کاهش خطا و نگرانی در تعیین جنسیت جنین است. همچنین، این آزمایش می تواند بعضی از بیماری های وابسته به جنس را نظیر سندروم ترنر، شناسایی کند.
- عدم وجود احتمال سقط جنین: از آنجائیکه این آزمایش بر روی خون مادر انجام می شود، برخلاف روش های تشخيصي تهاجمي، ريسكي براي سقط جنين ندارد. این به معنی افزایش امنیت و راحتی زنان باردار است.
- عدم تاثیر پذیری از بارداری های قبلی: از آنجائی که نیمه عمر DNA جنینی در خون مادر (cffDNA) کمتر از 2 ساعت است، بنابراین بارداری های قبلی اختلالی در نتیجه آزمایش ایجاد نمی کنند. این به معنی دقت بالاتر و کاهش تاثیر عوامل خارجی است.
- تشخیص زودهنگام: این آزمایش از هفته 10 بارداری قابل انجام است، در حالی که سایر آزمایشات غربالگری معمولاً در هفته 11 تا 14 بارداری انجام می شوند. این به معنی کاهش زمان انتظار و افزایش فرصت برای تصمیم گیری است.
- جوابدهی سریع: جواب بین 7 تا 10 روز کاری بعد از نمونه گیری آماده می شود، در حالی که در سایر آزمایشات غربالگری، جواب معمولاً بین 2 تا 3 هفته طول می کشد. این به معنی کاهش استرس و نگرانی است. در نهایت، یادآور می شود که این آزمایش فقط یک آزمایش غربالگری با قدرت تشخیص بالا بوده و هرگز نمی تواند جایگزین آزمایشات تشخيصي شود. بنابراین، در صورت دریافت یک نتیجه مثبت، لازم است که با پزشک خود مشورت کنید و در صورت لزوم، آزمایشات تشخيصي تهاجمي را انجام دهید.
تشخیص تریزومی 13 و 18
آزمایش NIPT می تواند برای تشخیص سندرم ادوارد (تریزومی 18) و سندرم پاتو (تریزومی 13) نیز مفید باشد. این آزمایش می تواند زنان باردار را که خطر داشتن یک جنین با این شرایط ژنتیکی و کروموزومی را دارند، شناسایی کند. این آزمایش با تشخیص قطعات DNA از مثانه جنین در نمونه خون مادر، بدون خطر سقط جنین، انجام می شود.
هزینه این آزمایش متفاوت است و بستگی به چند عامل دارد، از جمله:
- نوع آزمایش و شرایطی که برای آن غربالگری می شود.
- پوشش بیمه سلامت و سطح سقف خودپرداخت.
- تعداد نمونه های لازم و تکرار آزمایش.
- محل انجام آزمایش و هزینه های مربوط به نمونه گیری و جابجایی. به طور کلی، می توان گفت که هزینه یک آزمایش NIPT حدود 400 تا 500 دلار است. این هزینه توسط بیمه سلامت پوشش داده نمی شود و نیاز به پرداخت نقدی دارد. البته، بسته به شرایط خاص خود، ممکن است بتوانید با بیمه خود مذاکره کنید و قسمتی از هزینه را پوشش دهید. به هر حال، قبل از انجام آزمایش، بهتر است با بیمه خود تماس بگیرید و در مورد پوشش و قوانین آن اطلاعات کسب کنید.
علاوه بر هزینه خود آزمایش، ممکن است هزینه های دیگری نیز داشته باشید، مانند:
- هزینه مراجعه به پزشک برای دریافت ارجاع و سونوگرافی.
- هزینه تحلیل DNA جنین در آزمایشگاه.
- هزینه مشاوره ژنتیک قبل و بعد از آزمایش.
کیت های Cell Free DNA مجموعه ماناتک:
کیت استخراج با روش مغناطیسی:
کیت استخراج DNA بدون سلول امکان جداسازی سریع و کارامد DNA بدون سلول (cfDNA) از نمونه های سرم/ پلاسما را فراهم می کند. این کیت نمونه ها را با هیدرولیز آنزیمی لیز می کند، DNA بدون سلول را با جذب ویژه دانه های مغناطیسی با روکش تخصصی خالص می کند. از جمله مزیت ها: بکارگیری نانوذرات بی پتانسیل جهت جذب انتخابی و بکارگیری ترکیبات غیر سمی در پروسه شست و شو جهت حذف ذرات پریونی می باشد.
کلام آخر:
شرکت ماناتک انواع کیت های استخراج را برای سهولت و تسریع در کار شما با قیمت مناسب و کیفیت بالا در اختیار شما میگذارد. همچنین شما میتوانید برای خرید انواع دستگاه ترمال سایکلر PCR با کارشناسان حرفه ای ما تماس حاصل فرمایید.