کارگاه کلونینگ ژن: روش های کلاسیک و مدرن با رویکرد عملی

معرفی کارگاه

کلونینگ ژن یکی از تکنیک‌های بنیادی در زیست‌شناسی مولکولی و مهندسی ژنتیک است که امکان تکثیر، دست‌کاری و انتقال قطعات مشخصی از DNA به وکتورهای مناسب را فراهم می‌کند. در این کارگاه آموزشی دو ساعته، ابتدا مبانی کلونینگ ژن و اصول روش Restriction–Ligation Cloning معرفی شده و سپس انواع آنزیم‌های محدودکننده (Restriction Enzymes)، نحوه عملکرد آن‌ها و تفاوت روش‌های مختلف ایجاد انتهای سازگار در قطعات DNA بررسی می‌شود. همچنین روش‌های TA Cloning و TOPO Cloning به‌عنوان رویکردهای جایگزین کلونینگ معرفی می‌شوند.

در ادامه، یک گردش کار (Workflow) کامل و مرحله‌به‌مرحله از کلونینگ ژن با استفاده از روش Double Restriction Digestion ارائه می‌شود. این فرایند از انتخاب وکتور مناسب، کشت باکتری و استخراج پلاسمید آغاز شده و مراحل برش وکتور با آنزیم‌های محدودکننده، جداسازی و بازیابی قطعه موردنظر از ژل آگارز (Gel Extraction)، آماده‌سازی قطعات DNA و اتصال قطعه هدف (Insert) به وکتور برش‌خورده (Ligation) را در بر می‌گیرد.

یکی از بخش‌های مهم کارگاه به روش‌های تهیه قطعه Insert اختصاص دارد. در این بخش، تکثیر قطعه موردنظر با استفاده از PCR و پرایمرهای دارای توالی‌های اضافی (Overhangs) و بازوهای همولوگ (Homology Arms)، اصول طراحی این پرایمرها و همچنین روش تهیه قطعات DNA به‌صورت سنتتیک بررسی می‌شود. در روش سنتز مصنوعی، نحوه اتصال رشته‌های مکمل Sense و Antisense و آماده‌سازی قطعه دو‌رشته‌ای DNA برای ورود به فرایند کلونینگ توضیح داده می‌شود.

پس از مرحله اتصال Insert و وکتور، مراحل آماده‌سازی سلول‌های مستعد باکتریایی (Competent Cells)، ترنسفورماسیون در باکتری E. coli، انتخاب کلونی‌های نوترکیب، تأیید صحت کلونینگ با استفاده از Colony PCR و در نهایت تأیید توالی قطعه درج‌شده با روش Sanger Sequencing تشریح می‌شود.

در بخش پایانی، شرکت‌کنندگان با تکنیک‌های مدرن کلونینگ و کاربردهای آن‌ها آشنا می‌شوند. روش‌هایی مانند Gibson Assembly، In-Fusion Cloning، NEBuilder HiFi DNA Assembly، Golden Gate Assembly و Gateway Cloning معرفی شده و اصول عملکرد، ویژگی‌ها و تفاوت‌های کاربردی آن‌ها بررسی می‌شود تا مشخص شود هر تکنیک با توجه به نوع پروژه، ساختار قطعه DNA، تعداد قطعات موردنظر و هدف نهایی آزمایش، در چه شرایطی انتخاب مناسب‌تری خواهد بود.

هدف این کارگاه، ارائه یک دیدگاه جامع و کاربردی از فرایند کلونینگ ژن، از طراحی اولیه سازه و انتخاب روش مناسب تا تولید پلاسمید نوترکیب و تأیید نهایی صحت آن است.

مدرس کارگاه:

احسان کرامتی – دکترای تخصصی ژنتیک

آکادمی بیولوژی کرامتی

ویدیو کارگاه

اسلایدهای کارگاه