اهمیت تشخیص جهشهای ژن NRAS با استفاده از دیجیتال PCR (Digital PCR یا dPCR) بهویژه در زمینهی سرطانشناسی دقیق و پزشکی فردمحور بسیار بالاست. دلیل این اهمیت، هم به ماهیت بیولوژیکی جهشهای NRAS برمیگردد و هم به ویژگیهای فنی روش دیجیتال PCR.
ژن NRAS در بسیاری از سرطانها، بهخصوص ملانوم، لوسمی میلوئیدی حاد (AML)، و سرطان تیروئید دچار جهش میشود. این جهشها معمولاً در کدونهای 12، 13 و 61 رخ میدهند و باعث فعال شدن دائمی مسیرهای رشد و بقا در سلول میشوند. حضور این جهشها میتواند پیشآگهی بیمار را تغییر دهد و همچنین باعث مقاومت به برخی داروهای هدفمند شود. بنابراین شناسایی دقیق و سریع آنها قبل از شروع درمان بسیار حیاتی است.
روش دیجیتال PCR برای تشخیص این جهشها مزایای بسیار مهمی دارد. برخلاف روشهای کلاسیک مثل real-time PCR یا حتی NGS، دیجیتال PCR DNA نمونه را به هزاران یا میلیونها بخش مجزا تقسیم میکند (مانند قطره)، و هر واحد مستقل از بقیه بررسی میشود. این کار باعث افزایش چشمگیر حساسیت و دقت میشود، بهطوریکه میتوان حتی جهشهایی را که کمتر از ۱٪ از کل DNA را تشکیل میدهند نیز بهطور قطعی شناسایی کرد. این ویژگی بهخصوص در شرایطی که فقط از نمونههای مایع (cfDNA در خون) استفاده میشود، بسیار ارزشمند است. در بیماران مبتلا به سرطانهای خونی یا تومورهایی که دسترسی به بافت آنها دشوار است، cfDNA تنها منبع اطلاعات مولکولی موجود است.
از نظر بالینی، dPCR برای NRAS کاربردهای متعددی دارد: در مرحلهی تشخیص اولیه، برای بررسی اینکه آیا بیمار دارای جهشهای خاصی هست یا نه، که در تعیین نوع درمان مؤثر است. برای مثال در ملانوم، اگر جهش NRAS وجود داشته باشد، درمان با مهارکنندههای BRAF یا MEK میتواند اولویت پیدا کند یا برعکس، در صورت نبود جهش، برخی درمانها کنار گذاشته میشوند. همچنین در پایش درمان (monitoring)، میتوان سطح جهش NRAS را در خون بیمار طی درمان بررسی کرد؛ اگر سطح جهش کاهش یابد، احتمالاً درمان مؤثر است، و اگر افزایش یابد، میتواند نشانهی عود یا پیشرفت بیماری باشد.
در زمینهی ارزیابی مقاومت دارویی نیز، dPCR میتواند به تشخیص سریع جهشهای جدید کمک کند. برای مثال، بیمارانی که ابتدا پاسخ خوبی به درمان دادهاند اما سپس پیشرفت بیماری نشان میدهند، ممکن است بهدلیل ظهور جهش جدید در NRAS دچار مقاومت شده باشند. dPCR بهخاطر سرعت بالا و حساسیت زیاد، برای شناسایی چنین مواردی بسیار مناسب است.
در نهایت، dPCR نسبت به NGS ارزانتر، سریعتر، و برای بررسی هدفمند یک یا چند جهش مشخص بسیار مؤثرتر است. در حالی که NGS برای بررسی گسترده ژنوم مفید است، dPCR برای کاربردهای بالینی روزمره، بهویژه در شرایطی که پاسخ فوری نیاز است، انتخاب ایدهآلی است.
بنابراین، اهمیت dPCR در تشخیص جهشهای NRAS هم از نظر فنی به حساسیت، دقت و قابلیت کمّیسازی آن برمیگردد، و هم از نظر بالینی به نقش مستقیم این جهشها در انتخاب مسیر درمان، پیشبینی پاسخ، و پایش بیماری در بیماران سرطانی.
کیت NRAS Multiplex Mutation Screening
کیت NRAS Multiplex Mutation Screening ابزاری پیشرفته برای تشخیص سریع و دقیق جهشهای مختلف ژن NRAS در یک واکنش مولتیپلکس است. این کیتها معمولاً برای استفاده در آزمایشگاههای مولکولی طراحی شدهاند و به پژوهشگران و پزشکان اجازه میدهند تا طیف گستردهای از جهشهای نقطهای در ژن NRAS را بهصورت همزمان در یک نمونه بررسی کنند.
کاربرد اصلی این کیتها در حوزهی سرطانشناسی دقیق، بهویژه در سرطانهایی مانند ملانوم، لوسمی میلوئیدی حاد (AML)، سرطان تیروئید و کولورکتال است که در آنها جهش NRAS نقش تعیینکنندهای در مسیر درمان دارد. کیت غربالگری جهش چندگانه NRAS امکان سنجش و غربالگری جهشهای متعدد NRAS را در یک چاهک فراهم میکند، تشخیص حساس و دقیق را تا 0.5% ارائه میدهد و امکان غربالگری نمونههای متعدد را به شیوهای سریع و مقرون به صرفه فراهم میآورد.
عملکرد کلی کیت
کیت NRAS Multiplex معمولاً بر پایهی فناوری digital PCR (dPCR) یا real-time PCR (qPCR) عمل میکند. در این سیستم، چندین جفت پروب و پرایمر اختصاصی برای شناسایی جهشهای کلیدی ژن NRAS طراحی شدهاند، بهطوریکه در یک واکنش تکچاهکی (single-well) میتوان حضور یا عدم حضور چندین جهش را بهصورت همزمان بررسی کرد.
جهشهای قابل شناسایی با این کیت
این جهشها اغلب باعث فعال شدن دائمی پروتئین NRAS میشوند و در نتیجه سیگنالهای رشد سلولی بیوقفه فعال میمانند.
ویژگیهای کلیدی کیت
-
مولتیپلکس بودن: بررسی چندین جهش در یک واکنش واحد
-
حساسیت بالا: امکان تشخیص جهشهایی با فراوانی پایینتر از ۱٪ (در dPCR)
-
سرعت بالا: زمان اجرای آزمایش کوتاه است
-
مناسب برای cfDNA و DNA بافتی: میتوان از نمونه خون (بیوپسی مایع) یا بافت FFPE استفاده کرد
-
تفکیک نوع وحشی و جهشیافته در کانالهای جداگانه فلورسنت
-
قابل استفاده در سیستمهای دیجیتال PCR قطرهای یا پلتفرمهای qPCR خاص
اجزای کیت:
- مخلوط پرایمر NRAS (NR-PM): 440 میکرولیتر × 1 لوله
- کنترل منفی NRAS (NR-NC): 100 میکرولیتر × 1 لوله
اطلاعات نگهداری کیت: تمام اجزای کیت باید در فریزر 20- درجه سانتیگراد برای نگهداری طولانیمدت تا تاریخ انقضا نگهداری شوند. در صورت نگهداری صحیح، تا 6 چرخه انجماد و ذوب برای هر جزء کیت مجاز است.
نمونه:
نمونههای خون کامل 10 میلیلیتری جمعآوری شده در Streck Cell-Free DNA BCT پیشنهاد میشود.
روشهای استاندارد برای نگهداری/حمل و نقل نمونههای خون و جداسازی پلاسما را دنبال کنید.
روش آزمایش:
تمام اجزا را به دمای اتاق برسانید. با ورتکس کردن لوله به طور کامل مخلوط کنید تا یکنواختی حاصل شود.
cfDNA خون خالص شده به عنوان الگو در آزمایش استفاده میشود.
لوله های میکروفیوژ N × 1.5 میلیلیتری را آماده و برچسب بزنید (N = تعداد نمونهها + 2).
برای هر نمونه، مقدار ورودی cfDNA حدود 1-5 نانوگرم توصیه میشود.
واکنشها را طبق دستورالعملهای جدول زیر آماده کنید:
2x ddPCR Supermix for Probes (بدون dUTP): 11 میکرولیتر در N
مخلوط پرایمر NRAS: 4.4 میکرولیتر در N
حجم کل: 15.4 میکرولیتر در N
واکنشهای NTC (خالی) و کنترل منفی (موجود در کیت) توصیه میشوند.
به هر یک از لولههای نمونه، 15.4 میکرولیتر از مخلوط اجزای آماده شده در جدول بالا را اضافه کنید.
با ورتکس کردن لوله به طور کامل مخلوط کنید.
برای آمادهسازی واکنشهای ddPCR، دستورالعملهای سازنده را دنبال کنید.
پس از اتمام تولید قطرات، نگهدارنده کارتریج را از دستگاه تولید قطره خارج کنید. واشر را خارج کرده و دور بیندازید.
این فرآیند را برای تمام نمونهها تکرار کنید. پلیت PCR را بلافاصله با یک فویل قابل سوراخ کردن آببندی کنید.
پلیت واکنش را در دستگاه PCR قرار دهید و از برنامه زیر برای تکمیل PCR استفاده کنیدفعالسازی آنزیم: 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه با نرخ افزایش دما 2 درجه سانتیگراد بر ثانیه
60 سیکل: 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه با نرخ افزایش دما 2 درجه سانتیگراد بر ثانیه
60 درجه سانتیگراد به مدت 50 ثانیه با نرخ افزایش دما 2 درجه سانتیگراد بر ثانیه
غیرفعالسازی آنزیم: 98 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه با نرخ افزایش دما 2 درجه سانتیگراد بر ثانیه
نگهداری: 4 درجه سانتیگراد به مدت نامحدود با نرخ افزایش دما 2 درجه سانتیگراد بر ثانیه
پلیت را با فویل آلومینیومی بپوشانید و حداقل 2 ساعت، ترجیحاً یک شب، در دمای اتاق قبل از خواندن در دستگاه خوانش قطرات، انکوبه کنید.
در ادامه مقاله ای مربوط به دیجیتال PCR برای تشخیص ژن NRAS آورده شده است.
در این مطالعه، قابلیت Droplet Digital PCR (ddPCR) برای اندازهگیری کمی سطوح DNA جهشیافته BRAF و NRAS در گردش خون (پلاسما) بیماران ملانوم متاستاتیک که تحت درمان با داروهای هدفمند BRAF یا ایمونوتراپی قرار گرفتهاند، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که ddPCR قادر است تغییرات بالینی معنیداری را در سطوح کپیهای جهشیافته BRAF و NRAS در پلاسمای بیماران ملانوم مرحله IV اندازهگیری کند. این پلتفرم تحلیلی پتانسیل پایش پیشرفت بیماری و پاسخ بیمار به هر دو درمان هدفمند و مبتنی بر ایمنی را دارد و ممکن است یک مکمل مفید برای مطالعات تصویربرداری باشد.
این مقاله نشان میدهد که چگونه ddPCR به عنوان یک ابزار حساس برای پایش جهشهای NRAS در مایعات بیولوژیکی (مانند پلاسما) در بیماران سرطانی به کار میرود.
