کیت KRAS Multiplex Mutation Screening

لطفا برای تکمیل این فرم، جاوا اسکریپت را در مرورگر خود فعال کنید.

برای دریافت نمونه این محصول شماره همراه خود را وارد کنید *

نام آزمایشگاه/ مرکز تحقیقاتی *

ارسال

ژن KRAS چیست؟

ژن KRAS یکی از مهم‌ترین ژن‌ها در بدن انسان است که در تنظیم رشد، تقسیم و بقا‌ی سلول‌ها نقش دارد. این ژن متعلق به خانواده ژن‌های RAS است که پروتئین‌هایی با عملکرد پیام‌رسانی داخل‌سلولی تولید می‌کنند. این پیام‌رسان‌ها پس از دریافت سیگنال از گیرنده‌های سطح سلول مانند EGFR، سیگنال رشد را به هسته منتقل می‌کنند تا فرآیند تقسیم یا بقا در سلول آغاز شود. پروتئین KRAS عملکرد خود را از طریق اتصال و هیدرولیز مولکول GTP انجام می‌دهد؛ یعنی در حالت فعال به GTP متصل می‌شود و پس از انجام پیام‌رسانی آن را به GDP تبدیل کرده و غیرفعال می‌شود.

در حالت طبیعی این فرآیند به‌طور دقیق تنظیم می‌شود، اما در صورت جهش در ژن KRAS، این پروتئین در وضعیت فعال باقی می‌ماند و سیگنال رشد به‌طور مداوم به داخل سلول ارسال می‌شود، حتی در غیاب محرک‌های بیرونی. نتیجه این اختلال، رشد کنترل‌نشده و شکل‌گیری تومور است. شایع‌ترین جهش‌ها در KRAS معمولاً در اگزون ۲، به‌ویژه در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ اتفاق می‌افتد. این جهش‌ها اغلب باعث تغییر در ساختار پروتئین می‌شوند که مانع از غیرفعال شدن طبیعی آن می‌گردد.

جهش در KRAS به‌طور گسترده‌ای در انواع مختلفی از سرطان‌ها دیده می‌شود، از جمله سرطان ریه غیرسلولی (NSCLC)، سرطان پانکراس، سرطان کولورکتال، و در برخی موارد سرطان تخمدان و آندومتر. در سرطان‌های کولورکتال، جهش KRAS معمولاً با مقاومت به داروهای ضد EGFR همراه است، زیرا حتی با مهار گیرنده EGFR، مسیر پایین‌دستی که KRAS هدایت می‌کند همچنان فعال باقی می‌ماند. از این رو، شناسایی وضعیت KRAS پیش از شروع درمان‌های هدفمند اهمیت دارد، چرا که بیماران دارای KRAS موتاسیون مثبت معمولاً کاندیدای مناسبی برای درمان با مهارکننده‌های EGFR نیستند.

درمان‌های هدفمند مستقیماً بر پروتئین KRAS به‌سختی مؤثر واقع می‌شوند، زیرا ساختار این پروتئین کوچک و بسیار پایدار است، اما در سال‌های اخیر داروهایی مانند sotorasib که جهش خاص KRAS G12C را هدف قرار می‌دهند توسعه یافته‌اند. این درمان‌ها امید تازه‌ای برای بیماران با این جهش‌ها فراهم کرده‌اند، هرچند اثربخشی آن‌ها به نوع جهش و نوع سرطان بستگی دارد.

از نظر تشخیصی، برای بررسی وضعیت KRAS معمولاً از روش‌های مولکولی مانند real-time PCR، دیجیتال PCR یا توالی‌یابی نسل جدید (NGS) استفاده می‌شود. نمونه می‌تواند از بافت تومور یا از cfDNA موجود در خون بیمار گرفته شود. این نوع بررسی به‌ویژه برای تصمیم‌گیری درمانی و پیش‌بینی پاسخ به دارو اهمیت دارد.

ژن KRAS نه‌تنها یک نشانگر پیش‌آگهی در بسیاری از سرطان‌هاست، بلکه نقش پیش‌بینی‌کننده نیز دارد و وضعیت آن می‌تواند تعیین‌کننده نوع درمان باشد. شناخت بهتر عملکرد و جهش‌های آن در سال‌های اخیر باعث شده به یکی از مهم‌ترین اهداف تحقیقاتی و درمانی در انکولوژی تبدیل شود.

 اهمیت تشخیص ژن KRAS در بیماری ها به روش دیجیتال PCR:

اهمیت تشخیص جهش‌های ژن KRAS با استفاده از دیجیتال پی‌سی‌آر (Digital PCR یا dPCR) به‌دلیل ویژگی‌های خاص این ژن و نقش حیاتی آن در درمان‌های هدفمند بسیار بالا است. KRAS یکی از پرتکرارترین ژن‌هایی است که در انواع سرطان‌ها دچار جهش می‌شود، و بسیاری از این جهش‌ها مستقیماً روی پاسخ بیمار به درمان اثر می‌گذارند. از طرفی، شناسایی دقیق این جهش‌ها با روش‌هایی که حساسیت و دقت بالا دارند اهمیت حیاتی دارد، به‌ویژه وقتی مقدار جهش بسیار کم یا در نمونه‌های غیر تهاجمی مانند cfDNA موجود در پلاسما باشد.

دیجیتال PCR به‌عنوان نسل جدیدی از PCR، این امکان را فراهم می‌کند که بتوان حتی مقادیر بسیار پایین جهش‌های KRAS را با اطمینان بالا شناسایی کرد. این روش، برخلاف PCR معمولی یا real-time PCR، DNA را به هزاران یا حتی میلیون‌ها واکنش مجزا تقسیم می‌کند، به‌طوری که هر واحد (یا قطره) فقط حاوی یک نسخه یا هیچ نسخه‌ای از الگو است. با این تقسیم‌بندی دقیق، می‌توان حضور یا عدم حضور جهش خاصی را با تفکیک بسیار بالا شناسایی کرد، حتی اگر درصد آن نسبت به DNA نوع وحشی کمتر از یک درصد باشد.

اهمیت بالینی این موضوع در آنجاست که بسیاری از بیماران، به‌خصوص در مراحل اولیه یا در شرایطی که تومور سلولی کمتری در گردش است، دارای مقدار بسیار کم cfDNA جهش‌یافته در خون هستند. در این شرایط، روش‌های کم‌حساس‌تر ممکن است نتوانند وجود جهش را تشخیص دهند و بیمار به‌اشتباه منفی تلقی شود، در حالی‌که دیجیتال PCR قادر است حتی جهش‌های با فراوانی کمتر از ۰٫۱ درصد را نیز شناسایی کند.

تشخیص دقیق جهش‌های KRAS از این نظر اهمیت دارد که برخی از آن‌ها مانند جهش در کدون ۱۲ (مثلاً G12D، G12V یا G12C) مستقیماً با مقاومت به درمان‌های EGFR-targeted مرتبط هستند. در سرطان‌های کولورکتال، اگر بیمار دارای جهش KRAS باشد، درمان با داروهایی مثل cetuximab یا panitumumab بی‌اثر است. بنابراین، اگر dPCR بتواند با دقت این جهش را شناسایی کند، از تجویز بی‌مورد و پرهزینه‌ی این داروها جلوگیری می‌شود و مسیر درمان درست انتخاب می‌گردد.

علاوه بر تشخیص اولیه، dPCR در پایش پاسخ درمانی نیز کاربرد دارد. با استفاده از آن می‌توان cfDNA توموری را در طول درمان ردیابی کرد. اگر میزان جهش KRAS در خون کاهش یابد، نشان‌دهنده پاسخ به درمان است. اگر دوباره افزایش یابد، می‌تواند نشانه‌ای از عود بیماری یا مقاومت دارویی باشد. این موضوع در تصمیم‌گیری سریع و به‌موقع پزشک نقش کلیدی دارد.

همچنین، دیجیتال PCR برای بررسی جهش‌های نادر و مقاومتی که پس از درمان ظاهر می‌شوند بسیار مؤثر است. برای مثال، در سرطان ریه، جهش KRAS G12C هدف برخی داروهای نوین است. اگر این جهش به‌درستی و با دقت شناسایی نشود، بیمار ممکن است از دریافت درمان مؤثر محروم شود.

در مجموع، استفاده از dPCR برای تشخیص KRAS یک ابزار دقیق، سریع، حساس و قابل تکرار است که نه‌تنها در انتخاب درمان مناسب، بلکه در مانیتورینگ بیماری، ارزیابی پیشرفت یا عود تومور و تشخیص مقاومت ثانویه نیز نقش اساسی دارد. این روش امروزه بخشی جدایی‌ناپذیر از مدیریت مولکولی بیماران مبتلا به سرطان شده است، به‌ویژه در شرایطی که فقط نمونه‌های مایع (liquid biopsy) در دسترس باشد.

کیت KRAS Multiplex Mutation Screening

کیت KRAS Multiplex Mutation Screening ابزاری تخصصی برای شناسایی سریع و دقیق جهش‌های متعدد در ژن KRAS در یک واکنش منفرد است. این کیت برای استفاده در آزمایشگاه‌های تشخیص مولکولی طراحی شده و بر پایه فناوری digital PCR یا qPCR (بسته به نسخه) عمل می‌کند، و هدف آن بررسی وضعیت جهش‌های KRAS در نمونه‌های بیمار – به‌ویژه نمونه‌های مایع مانند cfDNA در پلاسما – است.

در بسیاری از سرطان‌ها مانند سرطان کولورکتال، ریه، پانکراس و سایر تومورها، جهش‌های نقطه‌ای در KRAS به‌ویژه در کدون‌های ۱۲، ۱۳ و ۶۱، نقش مهمی در پیشرفت بیماری و مقاومت به دارو دارند. این کیت‌ها به‌طور خاص برای شناسایی این جهش‌ها طراحی شده‌اند.

کیت KRAS Multiplex چه کاری انجام می‌دهد؟

این کیت قابلیت شناسایی همزمان چندین جهش خاص را در نواحی مهم ژن KRAS دارد. این جهش‌ها معمولاً شامل موارد زیر هستند:

• کدون 12: G12D، G12V، G12C، G12A، G12S، G12R

• کدون 13: G13D

• کدون 61: Q61H، Q61L، Q61R (در برخی نسخه‌ها)

هر کدام از این جهش‌ها می‌توانند با پاسخ متفاوت به درمان‌های هدفمند همراه باشند. این کیت معمولاً با استفاده از پروب‌های فلورسنت اختصاصی، هر جهش را در کانال فلورسنتی جداگانه تشخیص می‌دهد (مثلاً FAM برای جهش، HEX برای نوع وحشی)، به‌طوری که در یک واکنش می‌توان تعیین کرد که آیا نمونه حاوی نوع جهش‌یافته، نوع وحشی یا ترکیبی از هر دو است.

ویژگی‌ها و مزایای کیت KRAS Multiplex:

• تشخیص چند جهش در یک واکنش: صرفه‌جویی در زمان و هزینه نسبت به آزمایش جداگانه برای هر جهش

• حساسیت بالا: شناسایی جهش‌هایی با فراوانی بسیار پایین (مثلاً ۰٫۵٪ یا حتی کمتر در dPCR)

• قابل استفاده روی cfDNA: امکان غربالگری غیرتهاجمی از نمونه خون

• مناسب برای تصمیم‌گیری درمانی: تشخیص جهش KRAS پیش‌نیاز انتخاب درمان‌های ضد EGFR در بسیاری از سرطان‌هاست

• استفاده آسان و سریع: مراحل آماده‌سازی واکنش و تحلیل نتایج به‌صورت استاندارد طراحی شده.

راهنمای استفاده از کیت بررسی جهش‌های چندگانه KRAS

کاربرد کیت:

این کیت برای شناسایی و اندازه‌گیری چندین جهش مهم در ژن KRAS در یک واکنش منفرد طراحی شده است. این آزمایش امکان تشخیص حساس و دقیق جهش‌ها تا حد ۰٫۵٪ را فراهم می‌سازد و به کاربر اجازه می‌دهد نمونه‌های متعددی را به‌صورت سریع و مقرون‌به‌صرفه بررسی کند.

محتویات کیت:

1. محلول پرایمر KRAS – یک ویال ۴۴۰ میکرولیتر

2. کنترل منفی KRAS – یک ویال ۱۰۰ میکرولیتر

3. دفترچه راهنمای استفاده

شرایط نگهداری کیت:

تمام اجزای کیت باید در فریزر -۲۰ درجه سانتی‌گراد نگهداری شوند. هر جزء کیت را می‌توان حداکثر تا ۶ بار چرخه انجماد-ذوب قرار داد، به شرط رعایت شرایط نگهداری.

تجهیزات مورد نیاز :

• آب فاقد نوکلئاز

• لوازم معمول آزمایشگاهی (میکروتیوب، سمپلر، نوک، تروغ و…)

• مواد و تجهیزات مربوط به سیستم دیجیتال PCR

• کیت استخراج cfDNA از پلاسما

• دستگاه‌های ترموسایکلر و خوانش قطره‌ای

محدوده جهش‌های قابل شناسایی:

این کیت توانایی شناسایی طیف گسترده‌ای از جهش‌ها را در کدون‌های رایج KRAS دارد، از جمله:

• کدون‌های ۱۲، ۱۳، ۶۱، ۱۴۶

• انواع جهش‌های G12C, G12D, G12V, G13D, Q61H, A146T و بسیاری جهش‌های کمتر شایع دیگر

هشدارها و توصیه‌های ایمنی:

• با همه نمونه‌ها باید به‌صورت بالقوه عفونی رفتار شود.

• باید از دو ناحیه جداگانه برای مراحل پیش‌تکثیر و پس‌تکثیر در آزمایشگاه استفاده شود.

• تماس نمونه یا معرف با پوست، چشم یا سطوح باید اجتناب شود.

• تمام سطوح و ابزارها باید به‌طور منظم با محلول هیپوکلریت سدیم ۲٫۵٪ تا ۳٫۵٪ ضدعفونی شوند.

نوع نمونه:

• نمونه خون محیطی (حدود ۱۰ میلی‌لیتر) گرفته‌شده در لوله‌های مخصوص cfDNA

• استخراج DNA از پلاسما با کیت مناسب انجام می‌شود.

روند آزمایش:

• اجزای کیت به دمای اتاق رسانده شده، مخلوط و سانتریفیوژ می‌شوند.

• cfDNA تصفیه‌شده به‌عنوان الگو در واکنش استفاده می‌شود.

• واکنش PCR با استفاده از مخلوط پرایمر و سوپرمیکس در سیستم قطره‌ای دیجیتال (ddPCR) راه‌اندازی می‌شود.

• قطرات تولیدشده به پلیت PCR منتقل شده و در دستگاه ترموسایکلر قرار می‌گیرند.

• پس از تکمیل چرخه PCR، پلیت برای خوانش قطره‌ای آماده‌سازی و در دستگاه خوانشگر خوانده می‌شود.

• داده‌ها با نرم‌افزار تخصصی تحلیل و فراوانی جهش‌ها به‌صورت کمی تعیین می‌گردد.

تجزیه و تحلیل داده‌ها:

• کانال فلورسنت FAM برای شناسایی جهش‌یافته

• کانال HEX برای شناسایی نوع وحشی

• درصد جهش بر اساس نسبت بین تعداد قطرات جهش‌یافته و کل قطرات محاسبه می‌شود:

درصد جهش = تعداد جهش / (تعداد جهش + نوع وحشی) × ۱۰۰

ویژگی‌های عملکردی:

حساسیت تحلیلی:

در مطالعات انجام‌شده، این کیت توانست جهش‌هایی با غلظت ۰٫۵٪ را با ۱۰۰٪ حساسیت شناسایی کند؛ شامل جهش‌های:

• A146T

• Q61H

• G12C

• L19F

ویژگی تحلیلی:

در آزمایش با DNA نرمال (فاقد جهش)، هیچ نتیجه مثبت کاذبی گزارش نشد (ویژگی ۱۰۰٪).

کارایی بالینی:

عملکرد بالینی کیت با مقایسه نتایج آن با نتایج توالی‌یابی (NGS) ارزیابی شد. در آزمایش روی نمونه‌های ctDNA و بافت FFPE، نتایج کیت با نتایج NGS تطابق کامل داشت، به‌ویژه برای جهش‌های C-1 (مانند G12C)، که در ۳۷ مورد از ۳۷ نمونه مثبت شناسایی شد. برای برخی جهش‌های دیگر، تطابق وجود نداشت، احتمالاً به دلیل محدودیت در شیوع آن‌ها در جمعیت نمونه.

محدودیت‌ها:

• این کیت فقط برای غربالگری طراحی شده و نتیجه‌ی آن به‌تنهایی نباید مبنای تصمیم‌گیری نهایی پزشکی باشد.

• تنها جهش‌های مشخص‌شده در دفترچه راهنما شناسایی می‌شوند.

• برای رسیدن به دقت بالا، باید غلظت جهش حداقل ۰٫۵٪ باشد.

• نیاز به نمونه خون محیطی دارد.

در ادامه مقاله ای را بررسی کردیه ایم که در آن برای تشخیص ژن KRAS به روش دیجیتالPCR استفاده کرده اند.

برای دانلود مقاله کلیک کنید.

این مقاله به بررسی کاربرد روش droplet digital PCR برای شناسایی جهش‌های G12 و G13 در ژن KRAS از طریق DNA آزاد موجود در پلاسمای خون بیماران مبتلا به سرطان ریه غیرسلولی پیشرفته می‌پردازد. محققان با هدف ارزیابی ارزش پیش‌آگهی این جهش‌ها، نمونه‌های خون ۱۱۴ بیمار را جمع‌آوری کردند و پس از استخراج cfDNA، وجود یا عدم وجود جهش را با استفاده از ddPCR بررسی کردند. نتایج به‌وضوح نشان داد که حضور جهش KRAS در cfDNA با پیش‌آگهی ضعیف‌تر بیماران همراه است.

بیماران دارای این جهش‌ها زمان کوتاه‌تری تا پیشرفت بیماری داشتند و بقای کلی آن‌ها نیز کاهش یافته بود. آنالیزهای آماری نشان داد که حضور جهش KRAS نه‌تنها یک نشانگر همراه با پیشرفت بیماری است، بلکه به‌عنوان یک فاکتور مستقل می‌تواند برای پیش‌بینی روند بیماری و پاسخ به درمان استفاده شود.

در یک بخش دیگر از مطالعه، محققان تغییرات فراوانی جهش KRAS را در طول درمان در یک زیرمجموعه از بیماران به‌صورت طولی بررسی کردند. مشخص شد که در بیمارانی که پاسخ مناسبی به درمان داده بودند، میزان جهش در cfDNA کاهش یافته بود، و در مقابل در بیمارانی که دچار پیشرفت بیماری شدند، میزان جهش افزایش پیدا کرد. این یافته نشان می‌دهد که ddPCR نه‌تنها برای تشخیص اولیه جهش KRAS مفید است، بلکه می‌تواند به‌عنوان یک ابزار حساس برای پایش وضعیت بیماری در طول زمان و بررسی اثربخشی درمان نیز به‌کار گرفته شود.

مقاله نتیجه می‌گیرد که ddPCR بر روی cfDNA خون محیطی می‌تواند اطلاعات قابل اعتمادی درباره وضعیت جهش KRAS و سیر بالینی بیماری در اختیار پزشک قرار دهد، و در انتخاب درمان، پیش‌بینی پاسخ و زمان‌بندی تغییرات درمانی بسیار مؤثر باشد.