تکثیر مبتنی بر تهاجم رشته‌ای (SIBA)
“SIBA” در زمینه بیولوژی مولکولی به یک تکنیک تکثیر نوکلئیک اسید به نام “Strand Invasion Based Amplification” اشاره دارد. نام فارسی تکنیک “Strand Invasion Based Amplification” (SIBA) به صورت “تکثیر مبتنی بر تهاجم رشته‌ای” است. این تکنیک نسبتاً جدید است و به عنوان جایگزینی برای روش‌های بیشتر تأسیس‌شده‌ای مانند PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) ارائه شده است. در اینجا به جنبه‌های کلیدی تکنیک SIBA می‌پردازیم:
تکنیک “Strand Invasion Based Amplification” (SIBA) یک روش تکثیر اسید نوکلئیک است که برای تشخیص سریع و حساس اسیدهای نوکلئیک ویروسی، باکتریایی و سایر ارگانیسم‌های میکروبی استفاده می‌شود. این تکنیک بر اساس فرآیندی است که طی آن یک توالی DNA تک‌رشته‌ای با یک توالی DNA مکمل خود ترکیب می‌شود و به اصطلاح «تهاجم رشته‌ای» صورت می‌گیرد.
در این تکنیک، دو مرحله اساسی وجود دارد. ابتدا یک پروب یا آغازگر اختصاصی به یک بخش خاص از DNA هدف متصل می‌شود. این اتصال از طریق یک جفت شدن پایه‌ای بسیار دقیق انجام می‌گیرد، به این معنی که آغازگر فقط به توالی‌های خاصی از DNA که مکمل آن است، متصل می‌شود. این مرحله پایه‌ای برای تشخیص اختصاصی در این تکنیک است.
پس از اینکه آغازگر به DNA هدف متصل شد، آنزیم‌ها (معمولاً یک پلیمراز) شروع به تکثیر DNA در این ناحیه می‌کنند. تفاوت کلیدی SIBA با سایر روش‌های تکثیر مانند PCR این است که به جای استفاده از تغییرات دما برای جدا کردن رشته‌های DNA، از فرآیندهای آنزیمی و شیمیایی برای تحریک تهاجم رشته و جداسازی رشته‌ها استفاده می‌شود. این باعث می‌شود که SIBA بدون نیاز به دستگاه‌های پیچیده تغییر دما، مانند ترموسایکلر، قابل انجام باشد. در این روش، آنزیم‌هایی مانند هلیکاز‌ها که توانایی جداسازی رشته‌های DNA دوگانه را دارند، از طریق فرآیند تهاجم رشته‌ای، جفت‌سازی بین رشته‌های مکمل DNA را مختل می‌کنند و به آغازگر اجازه می‌دهند به رشته هدف متصل شود. با اتصال آغازگر به رشته هدف، تکثیر DNA آغاز می‌شود و محصول تکثیر به سرعت تولید می‌شود.
یکی از ویژگی‌های مهم تکنیک SIBA، سرعت و حساسیت بالای آن است. این تکنیک می‌تواند در زمان کوتاه و با حساسیت بالا مقادیر کمی از DNA هدف را شناسایی و تکثیر کند. این ویژگی‌ها به‌ویژه در مواردی که نیاز به تشخیص سریع پاتوژن‌ها در شرایط بحرانی وجود دارد، اهمیت پیدا می‌کنند. به عنوان مثال، در تشخیص عفونت‌های ویروسی یا باکتریایی که تشخیص سریع و زودهنگام آن‌ها می‌تواند به مدیریت بهتر بیماری‌ها کمک کند. از دیگر ویژگی‌های SIBA، عدم نیاز به تجهیزات پیشرفته برای تنظیم دما است، برخلاف PCR که نیاز به تغییرات دقیق دما برای انجام مراحل دناتوراسیون، اتصال و تکثیر دارد. این باعث می‌شود که SIBA در محیط‌های با منابع محدود، از جمله مناطق روستایی و کشورهای در حال توسعه، کاربردی‌تر و قابل‌دسترسی‌تر باشد.
این تکنیک به دلیل اختصاصیت بالای آن می‌تواند برای تشخیص هدفمند جهش‌ها و پاتوژن‌های خاص به کار رود. استفاده از آغازگرهایی که تنها با توالی‌های خاص هدف جفت می‌شوند، اطمینان از دقت بالای نتایج را تضمین می‌کند. این ویژگی آن را به ابزاری قدرتمند در تشخیص مولکولی و ژنتیک بالینی تبدیل می‌کند. در مجموع، تکنیک “Strand Invasion Based Amplification” (SIBA) یک روش نوآورانه برای تکثیر سریع و دقیق DNA است که به دلیل سادگی، سرعت، حساسیت و نیاز کمتر به تجهیزات پیچیده، در بسیاری از کاربردهای تشخیصی مولکولی، به‌ویژه در شرایطی که دسترسی به تجهیزات پیشرفته محدود است، استفاده می‌شود.
اصول و مکانیسم
- تکثیر ایزوترمال: برخلاف PCR که نیاز به چرخه‌های دمایی دارد، SIBA در دمای ثابت، معمولاً حدود 55-65 درجه سانتی‌گراد، عمل می‌کند. این ویژگی نیاز به تجهیزات را ساده‌تر می‌کند، زیرا نیازی به دستگاه‌های سیکلر حرارتی نیست.
- حمله رشته‌ای: این تکنیک از یک مکانیزم منحصر به فرد استفاده می‌کند که در آن اولیگونوکلئوتیدها (قطعات کوتاه DNA یا RNA) به نام پروب‌های حمله‌ای فرآیند تکثیر را آغاز می‌کنند. این پروب‌ها طراحی شده‌اند تا ساختار مفصل سه‌طرفه‌ای با DNA هدف ایجاد کنند، که به فرآیند حمله رشته‌ای کمک می‌کند.
- تکثیر: پس از اتصال پروب حمله‌ای به DNA هدف، یک DNA پلیمراز پروب را گسترش می‌دهد، که منجر به تکثیر نمایی توالی هدف می‌شود.
کاربردها
- تست تشخیصی: SIBA می‌تواند برای تشخیص DNA یا RNA بیماری‌زا استفاده شود، که در تشخیص بیماری‌های عفونی مفید است.
- تست ژنتیکی: برای تشخیص تغییرات ژنتیکی خاص یا تغییرات، در تحقیقات ژنتیکی و تشخیص‌های بالینی مناسب است.
مزایا
- سرعت: ماهیت ایزوترمال واکنش اجازه می‌دهد تکثیر به سرعت انجام شود، اغلب فرآیند در کمتر از یک ساعت تکمیل می‌شود.
- سادگی: عدم نیاز به تجهیزات چرخه‌بندی حرارتی SIBA را ساده‌تر و قابل حمل‌تر از PCR می‌کند، که برای تست‌های نقطه مراقبتی مفید است.
- حساسیت و اختصاصیت: SIBA برای داشتن حساسیت و اختصاصیت بالا به توالی هدف طراحی شده است، که احتمال خطاهای مثبت یا منفی را کاهش می‌دهد.
محدودیت‌ها
- نسبتاً جدید: به عنوان یک تکنیک جدیدتر، SIBA ممکن است به اندازه PCR پذیرفته یا درک نشده باشد و ممکن است داده‌های کمتری در مورد اثربخشی آن در برنامه‌های مختلف موجود باشد.
- بهینه‌سازی: طراحی پروب‌های حمله‌ای مؤثر می‌تواند پیچیده باشد و ممکن است بهینه‌سازی برای هدف‌ها یا شرایط مختلف نیاز داشته باشد.
مقایسه با PCR
در حالی که PCR استاندارد طلایی برای تکثیر نوکلئیک اسید است، SIBA مزایایی از نظر سادگی و نیاز به تجهیزات کمتر دارد. با این حال، PCR به طور کلی به عنوان روشی بیشتر چندمنظوره و مستقر در تحقیقات و تنظیمات بالینی در نظر گرفته می‌شود.
به طور خلاصه، تکنیک SIBA یک رویکرد نوآورانه در تکثیر نوکلئیک اسید است که مزایایی از نظر سادگی و فرآیند سریع ارائه می‌دهد. این تکنیک، به خصوص برای تشخیص‌های نقطه مراقبتی و موقعیت‌هایی که تست سریع و در محل مفید است، وعده‌دهنده است. با این حال، کمتر از PCR استقرار یافته است و ممکن است برای طیف گسترده‌تری از برنامه‌ها به توسعه و اعتبارسنجی بیشتری نیاز داشته باشد.
تکنیک Strand Invasion Based Amplification (SIBA) به دلیل سادگی و کارایی‌اش شناخته شده است، به‌ویژه به این دلیل که نیازی به تجهیزات چرخه‌بندی حرارتی که برای تکنیک‌هایی مانند PCR لازم است، ندارد. برای اجرای تکنیک SIBA، به تجهیزات و وسایل زیر نیاز خواهید داشت:
- دستگاه تکثیر ایزوترمال: تجهیزات کلیدی برای SIBA، یک دستگاه تکثیر ایزوترمال است. برخلاف دستگاه‌های PCR، این دستگاه‌ها دما را طی فرآیند تکثیر به طور ثابت حفظ می‌کنند. این دمای ثابت معمولاً در محدوده 55-65 درجه سانتی‌گراد برای SIBA است.
- میکروسنتریفیوژ: برای آماده‌سازی نمونه، به میکروسنتریفیوژ نیاز است تا اطمینان حاصل شود که واکنش‌دهنده‌ها و نمونه‌ها به درستی مخلوط شده‌اند و تفکیک باقیمانده سلول‌ها از نوکلئیک اسیدها در نمونه صورت گرفته است.
- سمپلر و سر سمپلر آن: دقت در پیپتینگ برای دقت این تکنیک حیاتی است. یک مجموعه پیپت میکرویی که قادر به اندازه‌گیری و انتقال حجم‌های کوچک (مانند 1-1000 میکرولیتر) است، لازم است.
- پلیت ها و میکروتیوب های بدون نوکلئاز: برای جلوگیری از آلودگی، از لوله‌ها و صفحات بدون نوکلئاز برای تنظیم مخلوط‌های واکنش استفاده می‌شود.
- ریجنت ها و کیت‌ها: واکنش‌دهنده‌های خاصی برای SIBA لازم است، از جمله پروب‌های اولیگونوکلئوتیدی (پروب‌های حمله)، DNA پلیمراز، نوکلئوتیدها و بافرها. این‌ها اغلب در کیت‌های تخصصی SIBA ارائه می‌شوند.
- تجهیزات آماده‌سازی نمونه: بسته به نوع نمونه، ممکن است به وسایل اضافی برای استخراج و تصفیه نوکلئیک اسیدها نیاز باشد. این می‌تواند شامل بافرهای لیزیس، کیت‌های استخراج و سایر مصرفی‌ها باشد.
- تجهیزات تشخیص فلورسنس (در صورت لزوم): اگر آزمایش SIBA طوری طراحی شده باشد که در صورت تکثیر موفق، یک سیگنال فلورسنت تولید کند، به یک خواننده فلورسنس یا دستگاه تکثیر ایزوترمال واقعی قادر به تشخیص این سیگنال‌ها نیاز خواهید داشت.
- تجهیزات حفاظتی: تجهیزات ایمنی استاندارد آزمایشگاهی، از جمله دستکش، عینک ایمنی و روپوش آزمایشگاهی، برای اطمینان از دست زدن ایمن به نمونه‌های بیولوژیکی و مواد شیمیایی ضروری هستند.
- ذخیره‌سازی سرد: برای نگهداری واکنش‌دهنده‌ها و آنزیم‌ها، به یخچال یا فریزر نیاز است، زیرا بسیاری از این مؤلفه‌ها نیاز به ذخیره‌سازی در دماهای پایین دارند.
- نرم‌افزار تجزیه و تحلیل داده‌ها: برای تفسیر نتایج، به ویژه در آزمایش‌های کمی یا واقعی، ممکن است به نرم‌افزار مناسب نیاز باشد.
سادگی روش SIBA، به ویژه ماهیت ایزوترمال آن، آن را برای استفاده در طیف گسترده‌ای از تنظیمات، از جمله تشخیص‌های نقطه مراقبتی و تشخیص‌های میدانی، در مقایسه با روش‌هایی که نیاز به تجهیزات بیشتری دارند مانند PCR، دسترس‌تر و عملی‌تر می‌کند.
تکنیک Strand Invasion Based Amplification (SIBA) برای تشخیص انواع مختلف عوامل بیماری‌زا، از جمله ویروس‌های آنفلوانزا A و B، مورد بررسی قرار گرفته است. در اینجا به مروری بر نحوه استفاده از SIBA در این زمینه می‌پردازیم:
SIBA برای تشخیص آنفلوانزا
شناسایی هدف: در مورد آنفلوانزا A و B، SIBA برای هدف‌گیری توالی‌های ژنتیکی منحصر به فرد این ویروس‌ها طراحی شده است. برای مثال، بخش‌هایی از RNA ویروسی که در سویه‌های مختلف مشترک هستند، ممکن است به عنوان هدف انتخاب شوند.
تشخیص سریع و دقیق: مزیت اصلی استفاده از SIBA برای تشخیص آنفلوانزا توانایی آن در شناسایی سریع و دقیق وجود ویروس است. این برای تشخیص و درمان به موقع، به خصوص در طی شیوع آنفلوانزا، حیاتی است.
تکثیر ایزوترمال: از آنجا که SIBA در دمای ثابت عمل می‌کند، فرآیند را ساده می‌کند و آن را برای تست‌های نقطه مراقبتی مناسب می‌سازد که در مدیریت بیماری‌های عفونی مانند آنفلوانزا حیاتی است.
توسعه و اعتبارسنجی
طراحی پروب: باید پروب‌های خاصی برای ویروس‌های آنفلوانزا A و B توسعه یابند. این پروب‌ها به RNA ویروسی متصل شده و فرآیند تکثیر را آغاز می‌کنند.
حساسیت و اختصاصیت: حساسیت (توانایی تشخیص ویروس هنگام وجود آن) و اختصاصیت (توانایی تشخیص فقط ویروس مورد نظر و نه سایر موجودات) عوامل بحرانی هستند. باید SIBA به دقت آزمایش شود تا اطمینان حاصل شود که می‌تواند به طور قابل اعتمادی بین آنفلوانزا A، B و سایر عوامل بیماری‌زای تنفسی تمایز قائل شود.
آزمایش‌های بالینی و مطالعات: برای اینکه SIBA به طور گسترده در تنظیمات بالینی پذیرفته شود، باید آزمایش‌ها و مطالعات اعتبارسنجی گسترده‌ای را برای تأیید کارایی و قابلیت اطمینان آن در جمعیت‌ها و تنظیمات مختلف انجام دهد.
مقایسه با سایر تکنیک‌ها
روش‌های مبتنی بر PCR: PCR، به ویژه RT-PCR (Reverse Transcription PCR)، استاندارد فعلی برای تشخیص آنفلوانزا است. SIBA یک جایگزین بالقوه ارائه می‌دهد که ممکن است سریع‌تر باشد یا برای تست‌های نقطه مراقبتی مناسب‌تر باشد اما باید با استانداردهای بالای حساسیت و اختصاصیت PCR هم‌خوانی داشته باشد.
تست‌های تشخیصی سریع آنفلوانزا (RIDTs): این تست‌ها سریع‌تر هستند اما کمتر از PCR حساسیت دارند. SIBA ممکن است یک میانه ارائه دهد و نتایج سریع‌تری نسبت به PCR فراهم کند در حالی که حساسیت بالاتری نسبت به RIDTs حفظ می‌کند.
پتانسیل و چالش‌ها
بیشتر بخوانید:معرفی تکنیک توالی یابی نسل جدید (NGS)
تشخیص زودهنگام: تشخیص زودهنگام و سریع آنفلوانزا برای درمان مؤثر و کنترل گسترش ویروس، به ویژه در جمعیت‌های آسیب‌پذیر، حیاتی است.
تأثیرات بهداشت جهانی: با توجه به بار جهانی آنفلوانزا، هر بهبودی در تکنیک‌های تشخیصی، مانند پتانسیل ارائه شده توسط SIBA، می‌تواند مزایای بهداشت عمومی قابل توجهی داشته باشد.
چالش‌ها: یکی از چالش‌ها برای SIBA در این زمینه تضمین عملکرد ثابت در برابر سویه‌های مختلف آنفلوانزا و در انواع مختلف نمونه‌ها (مانند نمونه‌های بینی یا گلو) است.
به طور خلاصه، کاربرد SIBA برای تشخیص آنفلوانزا A و B یک حوزه تحقیقاتی امیدوارکننده است که مزایای بالقوه‌ای از نظر سرعت و سادگی برای تست‌های نقطه مراقبتی ارائه می‌دهد. با این حال، باید استانداردهای سختگیرانه‌ای برای حساسیت و اختصاصیت داشته باشد و مزایای واضحی نسبت به روش‌های موجود مانند PCR و RIDTs برای کسب پذیرش گسترده در زمینه تشخیص‌های بالینی نشان دهد.
RT-SIBA، یا Reverse Transcription Strand Invasion Based Amplification، اقتباسی از تکنیک SIBA است که به طور خاص برای تشخیص ویروس‌های RNA مانند آنفلوانزا A و B طراحی شده است. از آنجایی که ویروس‌های آنفلوانزا ویروس‌های RNA هستند، روش RT-SIBA شامل یک مرحله ترانسکریپتاز معکوس برای تشخیص این عوامل بیماری‌زا است. در اینجا نحوه کار RT-SIBA در زمینه تشخیص آنفلوانزا A و B را توضیح می‌دهیم:
اصول و مکانیزم
ترانسکریپتاز معکوس: RT-SIBA با ترانسکریپتاز معکوس شروع می‌شود، جایی که RNA ویروس آنفلوانزا به DNA تکمیلی (cDNA) تبدیل می‌شود. این مرحله ضروری است زیرا تکنیک SIBA در اصل برای تکثیر DNA طراحی شده است، نه RNA.
تکثیر مبتنی بر حمله رشته‌ای: پس از ترانسکریپتاز معکوس، فرآیند استاندارد SIBA اتفاق می‌افتد. پروب‌های حمله‌ای خاص برای آنفلوانزا A یا B برای شروع تکثیر cDNA هدف استفاده می‌شوند.
تکثیر ایزوترمال: مشابه SIBA، RT-SIBA نیز در دمای ثابت عمل می‌کند که نیاز به چرخه‌بندی حرارتی را از بین می‌برد.
کاربردها در تشخیص آنفلوانزا
تشخیص سریع و خاص: RT-SIBA می‌تواند به سرعت وجود ویروس‌های آنفلوانزا A و B را در نمونه‌های بیمار تشخیص دهد که این امر آن را به ابزاری بالقوه مفید برای تشخیص سریع، به ویژه در شرایط شیوع بیماری، تبدیل می‌کند.
مناسب برای تست‌های نقطه مراقبتی: سادگی و ماهیت ایزوترمال RT-SIBA آن را برای تنظیمات نقطه مراقبتی مناسب می‌سازد، جایی که نتایج سریع و دقیق ضروری است.
توسعه و اعتبارسنجی
- طراحی پروب: اثربخشی RT-SIBA به شدت به طراحی پروب‌های حمله‌ای بستگی دارد. این پروب‌ها باید به شدت خاص توالی‌های RNA ویروسی آنفلوانزا A و B باشند تا از نتایج مثبت کاذب جلوگیری شود.
- حساسیت و اختصاصیت: همانند هر روش تشخیصی دیگر، RT-SIBA باید حساسیت و اختصاصیت بالایی را نشان دهد. آزمایش‌های بالینی و مطالعات برای تأیید کارایی و قابلیت اطمینان آن لازم است.
مزایای نسبت به سایر تکنیک‌ها
- سرعت و سادگی: RT-SIBA یک جایگزین سریع‌تر و ساده‌تر به روش‌های سنتی‌تر مانند RT-PCR ارائه می‌دهد که در شرایط حساس زمانی مفید است.
- عدم نیاز به تجهیزات گران‌قیمت: ماهیت ایزوترمال واکنش به این معنی است که نیازی به دستگاه‌های حرارتی پیچیده و گران‌قیمت نیست.
چالش‌ها و نکات قابل توجه
- اعتبارسنجی: به عنوان یک تکنیک نسبتاً جدید، RT-SIBA باید مورد ارزیابی گسترده قرار گیرد تا دقت و قابلیت اطمینان آن در تنظیمات بالینی مختلف تضمین شود.
- مقایسه با روش‌های مستقر: RT-PCR استاندارد فعلی برای تشخیص آنفلوانزا است. RT-SIBA باید عملکرد مشابه یا برتری نسبت به آن را نشان دهد تا به طور گسترده پذیرفته شود.
به طور خلاصه، RT-SIBA یک رویکرد امیدوارکننده برای تشخیص سریع آنفلوانزا A و B ارائه می‌دهد، که مزایای تکثیر بر پایه حمله رشته‌ای را با ترانسکریپتاز معکوس برای تشخیص ویروس‌های RNA ترکیب می‌کند. پتانسیل آن برای تشخیص سریع، دقیق و با تجهیزات کم این روش را به ویژه برای تست‌های نقطه مراقبتی جذاب می‌سازد، اگرچه همچنان به ارزیابی دقیق و مقایسه با روش‌های مستقر مانند RT-PCR نیاز دارد.
برای مطالعه بیشتر به مفاله ذیل مراجعه فرمایید
تکنیک SIBA یک روش نوین ایزوترمال برای تکثیر DNA است که به دلیل دقت و حساسیت بالا، کاربرد گسترده‌ای در تشخیص بیماری‌ها و آنالیز ژنتیکی دارد. این تکنیک مبتنی بر تهاجم رشته‌ای است و نیاز به تجهیزات پیچیده یا چرخه‌های حرارتی ندارد. SIBA با استفاده از اولیگو نوکلئوتیدهای تهاجمی (IO) و آنزیم‌های خاص، قادر به شناسایی و تکثیر DNA هدف با دقت بالا و بدون ایجاد تکثیر غیر اختصاصی است.
برای طلاعات بیشتر با همکاران ما در شرکت ماناتک در تماس باشید.
