تفاوت روش Reverse Transcription PCR (RT-PCR) و Real-Time PCR (qPCR)

everse Transcription PCR (RT-PCR) و Real-Time PCR (qPCR) دو تکنیک مهم در زیست‌شناسی مولکولی هستند:

RT-PCR: این روش برای تبدیل RNA به cDNA و سپس تکثیر cDNA با استفاده از PCR استفاده می‌شود. این تکنیک عمدتاً برای بررسی RNA مانند ویروس‌های RNA (مثل SARS-CoV-2) و مطالعه بیان ژن‌ها به کار می‌رود. تحلیل این روش معمولاً کیفی است و وجود یا عدم وجود ژن مورد نظر در نمونه مشخص می‌شود.

Real-Time PCR (qPCR): در این روش، میزان DNA در زمان واقعی با استفاده از رنگ‌های فلورسانس یا پروب‌های خاص اندازه‌گیری می‌شود. این تکنیک به تحلیل کمی DNA یا RNA تبدیل شده به cDNA می‌پردازد و می‌تواند تغییرات دقیق در بیان ژن‌ها را اندازه‌گیری کند. qPCR برای کاربردهایی مانند اندازه‌گیری بار ویروسی و تحلیل بیان ژن‌ها در تحقیقات گسترده استفاده می‌شود.

در این مقاله نکات کلیدی و تفاوت‌های عملی و کاربردی این دو تکنیک به‌طور کامل توضیح داده خواهد شد:

1. کاربردها:
   • RT-PCR برای تحلیل کیفی بیان ژن استفاده می‌شود، به این معنا که می‌تواند حضور یا عدم حضور یک RNA خاص را در نمونه تعیین کند.
   • qPCR علاوه بر تشخیص کیفی، می‌تواند به‌طور کمی مقدار RNA یا DNA موجود در نمونه را اندازه‌گیری کند و امکان پایش دقیق تغییرات بیان ژن را فراهم می‌کند.
2. مکانیسم عمل:
   • در RT-PCR، ابتدا RNA با استفاده از آنزیم Reverse Transcriptase به cDNA تبدیل می‌شود و سپس PCR استاندارد روی این cDNA انجام می‌شود تا ژن مورد نظر تکثیر شود. این فرآیند پس از پایان PCR بررسی می‌شود، معمولاً با استفاده از الکتروفورز ژل.
   • در qPCR، همان فرآیند PCR اجرا می‌شود، اما میزان DNA یا cDNA تولید شده در زمان واقعی با استفاده از سیگنال‌های فلورسانس ثبت می‌شود. این روش به محققان اجازه می‌دهد که در هر چرخه PCR میزان دقیق DNA را مشاهده کنند.
3. حساسیت و دقت:
   • qPCR به دلیل استفاده از پروب‌های فلورسانس و پایش در زمان واقعی، حساسیت و دقت بیشتری نسبت به RT-PCR دارد و می‌تواند تغییرات دقیق‌تر و کوچک‌تری را شناسایی کند.
4. کاربردهای عملی:
   • RT-PCR بیشتر برای تشخیص کیفی، مانند تشخیص حضور RNA ویروسی در نمونه‌های بالینی استفاده می‌شود.
   • qPCR بیشتر برای تشخیص کمی، مانند اندازه‌گیری بار ویروسی یا تعیین سطح بیان ژن‌ها در تحقیقات استفاده می‌شود.

به‌طور کلی، RT-PCR برای تشخیص کیفی RNA کاربرد دارد، در حالی که qPCR به دلیل دقت بالاتر و توانایی اندازه‌گیری کمی، در تشخیص کمی و تحقیقاتی گسترده‌تر استفاده می‌شود.

Reverse Transcription PCR (RT-PCR) و Real-Time PCR (qPCR) دو تکنیک بسیار مهم در علم زیست‌شناسی مولکولی هستند که برای بررسی و تجزیه‌وتحلیل اسیدهای نوکلئیک (RNA و DNA) استفاده می‌شوند. این دو تکنیک گاهی به دلیل شباهت‌های اسمی با هم اشتباه گرفته می‌شوند، اما در اصل دارای تفاوت‌های مهمی در هدف، روش و کاربرد هستند. در ادامه به توضیح کامل RT-PCR و سپس به مقایسه و تفاوت آن با Real-Time PCR پرداخته خواهد شد.

Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

RT-PCR یک تکنیک برای تشخیص و تکثیر RNA است که از طریق تبدیل RNA به cDNA (DNA مکمل) با استفاده از آنزیم Reverse Transcriptase و سپس انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) برای تکثیر این cDNA انجام می‌شود. این تکنیک به منظور تشخیص و اندازه‌گیری RNA، مانند mRNA (که بیان ژن‌ها را نشان می‌دهد) مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش خصوصاً در تحقیقات ژنتیکی، بررسی‌های ویروسی (مانند تشخیص ویروس‌های RNA مانند SARS-CoV-2) و بررسی بیان ژن‌ها کاربرد دارد.

مراحل اجرای RT-PCR:

1. استخراج RNA: در ابتدا، RNA از نمونه (مثل سلول‌ها یا ویروس‌ها) استخراج می‌شود.
2. تبدیل RNA به cDNA: با استفاده از آنزیم Reverse Transcriptase، RNA به cDNA تبدیل می‌شود. این مرحله حیاتی است زیرا PCR قادر به تکثیر مستقیم RNA نیست و به cDNA نیاز دارد.
3. انجام PCR بر روی cDNA: پس از تولید cDNA، همانند PCR معمولی، cDNA به عنوان قالب برای تکثیر قطعات خاص DNA مورد نظر با استفاده از توالی‌های آغازگر (پرایمرها) و آنزیم DNA پلیمراز تکثیر می‌شود.

مزایای RT-PCR:

• بررسی RNA ویروس‌ها و mRNA: RT-PCR امکان بررسی RNA ویروس‌ها یا RNA پیام‌رسان را فراهم می‌کند که بیان ژن‌ها را نشان می‌دهد.
• حساسیت بالا: این روش بسیار حساس است و قادر به تشخیص حتی مقادیر کم RNA در نمونه است.

محدودیت‌ها:

• نیمه‌کمی: RT-PCR استاندارد یک روش نیمه‌کمی است، به این معنی که می‌تواند حضور یا عدم حضور RNA را نشان دهد، اما میزان دقیق RNA در نمونه را به‌صورت مستقیم تعیین نمی‌کند.
• نیاز به مراحل چندگانه: چون ابتدا باید RNA به cDNA تبدیل شود و سپس PCR انجام شود، این روش چند مرحله‌ای و زمان‌برتر از تکنیک‌های دیگر است.

Real-Time PCR (qPCR)

Real-Time PCR که به عنوان Quantitative PCR (qPCR) نیز شناخته می‌شود، یک تکنیک پیشرفته‌تر از PCR استاندارد است که امکان اندازه‌گیری دقیق و هم‌زمان (در زمان واقعی) تکثیر DNA را فراهم می‌کند. در این روش، مقدار DNA تکثیر شده در هر چرخه PCR با استفاده از فلورسانس اندازه‌گیری می‌شود. از qPCR برای بررسی میزان بیان ژن‌ها یا تعیین بار ویروسی استفاده می‌شود.

مراحل اجرای qPCR:

1. آماده‌سازی DNA یا cDNA: در این روش می‌توان مستقیماً از DNA یا cDNA تولید شده از RNA (در حالت qRT-PCR) استفاده کرد.
2. انجام PCR همراه با فلورسانس: در qPCR، یک رنگ فلورسانس (مثل SYBR Green یا پروب‌های TaqMan) به واکنش PCR اضافه می‌شود. این رنگ با DNA تکثیر شده واکنش می‌دهد و به هر چرخه PCR سیگنال فلورسانس تولید می‌کند.
3. اندازه‌گیری هم‌زمان فلورسانس: دستگاه qPCR به طور هم‌زمان میزان افزایش سیگنال فلورسانس را در هر چرخه PCR اندازه‌گیری می‌کند و از این طریق می‌تواند میزان تکثیر DNA را دقیقاً در طول فرآیند نظارت کند.

مزایای Real-Time PCR:

• اندازه‌گیری کمی: بر خلاف RT-PCR که فقط حضور یا عدم حضور RNA را نشان می‌دهد، qPCR می‌تواند به طور دقیق مقدار DNA یا RNA (در qRT-PCR) را در نمونه اندازه‌گیری کند. این امکان برای محاسبه میزان بیان ژن یا بار ویروسی مفید است.
• زمان سریع‌تر و ساده‌تر: qPCR در زمان کوتاه‌تر و با دقت بیشتری نسبت به PCR سنتی انجام می‌شود و نیاز به الکتروفورز ژل برای تأیید نتایج نیست.
• دقت بالا: به دلیل اندازه‌گیری هم‌زمان فلورسانس، qPCR حساسیت و دقت بسیار بالایی دارد و به راحتی مقادیر اندک DNA یا RNA را شناسایی می‌کند.

تفاوت‌های کلیدی بین RT-PCR و Real-Time PCR

1. هدف و نوع مولکول بررسی‌شده:
   • RT-PCR برای تبدیل RNA به cDNA و سپس تکثیر آن به کار می‌رود، بنابراین معمولاً در تحقیقات مرتبط با RNA مانند بررسی بیان ژن‌ها یا شناسایی ویروس‌های RNA مورد استفاده قرار می‌گیرد.
   • Real-Time PCR (qPCR) به طور خاص برای اندازه‌گیری کمی و دقیق DNA یا cDNA استفاده می‌شود. این روش می‌تواند در زمان واقعی تعداد نسخه‌های DNA یا RNA تکثیر شده را اندازه‌گیری کند.
2. ماهیت کمی یا نیمه‌کمی:
   • RT-PCR استاندارد یک روش نیمه‌کمی است که صرفاً می‌تواند وجود یا عدم وجود RNA را نشان دهد، ولی مقدار دقیق RNA یا cDNA در نمونه را ارائه نمی‌دهد.
   • Real-Time PCR (qPCR) یک روش کاملاً کمی است که به طور دقیق تعداد نسخه‌های مولکول مورد نظر را در زمان واقعی اندازه‌گیری می‌کند و می‌تواند بیان ژن‌ها یا بار ویروسی را محاسبه کند.
3. روش تشخیص محصول نهایی:
   • در RT-PCR، پس از پایان واکنش PCR، محصولات تکثیر شده معمولاً با استفاده از روش‌هایی مثل الکتروفورز ژل آگارز برای تأیید حضور DNA بررسی می‌شوند.
   • در qPCR، نیازی به الکتروفورز نیست، زیرا سیگنال فلورسانس به‌صورت مستقیم در طول واکنش PCR توسط دستگاه اندازه‌گیری می‌شود و این سیگنال هم‌زمان با تکثیر DNA افزایش می‌یابد.
4. مراحل اجرایی:
   • در RT-PCR، ابتدا RNA باید به cDNA تبدیل شود و سپس PCR انجام گیرد. این روش شامل دو مرحله است.
   • در qPCR، PCR همراه با تشخیص فلورسانس انجام می‌شود و تمام فرآیند در یک مرحله تکثیر و تشخیص صورت می‌گیرد.

تفاوت واقعی بین RT-PCR و Real-Time PCR (qPCR) به کاربرد، فرآیند و هدف آن‌ها برمی‌گردد. RT-PCR برای تشخیص RNA استفاده می‌شود. این روش RNA را به cDNA تبدیل می‌کند و سپس از طریق PCR، cDNA تکثیر می‌شود. این روش بیشتر برای مطالعه مولکول‌های RNA، مانند mRNA که بیان ژن‌ها را نشان می‌دهد یا RNA ویروسی (مثل SARS-CoV-2) به کار می‌رود. این روش معمولاً کیفی یا نیمه‌کمی است، یعنی نشان می‌دهد که RNA هدف در نمونه وجود دارد یا نه، اما مقدار دقیق آن را تعیین نمی‌کند.

در مقابل، Real-Time PCR یا qPCR یک روش کمی است که در آن مقدار DNA یا cDNA در زمان واقعی (یعنی حین انجام PCR) اندازه‌گیری می‌شود. qPCR به‌جای بررسی محصول PCR در انتهای آزمایش، از سیگنال‌های فلورسانس برای اندازه‌گیری مستقیم در هر چرخه PCR استفاده می‌کند. این امکان را فراهم می‌کند که به‌طور دقیق مقدار بیان ژن یا بار ویروسی اندازه‌گیری شود. این روش نیازی به انجام الکتروفورز یا مراحل اضافی ندارد و به دلیل دقت و سرعت بالاتر، بیشتر در مطالعاتی که نیاز به اندازه‌گیری کمی دارند، استفاده می‌شود.

خلاصه‌ی یک مقاله علمی از Springer که تفاوت این دو روش را بررسی می‌کند، به این نکته اشاره می‌کند که RT-PCR عمدتاً برای تشخیص کیفی RNA به کار می‌رود، در حالی که Real-Time PCR روشی کمی و دقیق‌تر برای سنجش بیان ژن و بار ویروسی است. این مقاله همچنین روش‌های مختلف تشخیص فلورسانس در qPCR را توضیح می‌دهد که از پروب‌های مختلف برای تشخیص هم‌زمان و دقیق تکثیر DNA استفاده می‌کنند.

روش انجام Reverse Transcription PCR (RT-PCR) و Real-Time PCR (qPCR) به یکدیگر مرتبط هستند، اما تفاوت‌هایی در مراحل و اهداف آن‌ها وجود دارد. در ادامه، این دو تکنیک را به صورت پیوسته توضیح می‌دهم:

RT-PCR با استخراج RNA از نمونه آغاز می‌شود. این RNA ممکن است از سلول‌ها، ویروس‌ها یا هر منبع بیولوژیکی دیگر باشد. سپس در مرحله‌ای مهم، RNA با استفاده از آنزیم Reverse Transcriptase به DNA مکمل (cDNA) تبدیل می‌شود. دلیل این تبدیل این است که PCR قادر به تکثیر RNA نیست و برای تکثیر باید RNA به cDNA تبدیل شود. پس از تولید cDNA، این DNA به‌عنوان الگوی اصلی وارد واکنش PCR می‌شود. پرایمرهای خاصی که به توالی هدف cDNA متصل می‌شوند، به آنزیم DNA پلیمراز کمک می‌کنند تا قطعات خاصی از cDNA را تکثیر کند. در نهایت، محصولات تکثیر شده معمولاً از طریق الکتروفورز ژل بررسی می‌شوند تا مشخص شود که آیا محصول PCR تولید شده است یا خیر. این روش معمولاً به صورت کیفی یا نیمه‌کمی استفاده می‌شود و نشان می‌دهد که آیا RNA مورد نظر در نمونه وجود داشته یا نه.

Real-Time PCR (qPCR) بعد از انجام مراحل مشابه با PCR سنتی برای تکثیر DNA، تفاوت اصلی را در نحوه اندازه‌گیری محصولات تکثیر شده نشان می‌دهد. در qPCR، فرآیند تکثیر DNA با استفاده از سیگنال‌های فلورسانس به صورت لحظه‌ای و در طول چرخه‌های PCR نظارت می‌شود. به‌جای نیاز به انجام الکتروفورز در پایان واکنش برای مشاهده محصولات، یک دستگاه فلورسانس تغییرات در سیگنال نوری را در هر چرخه PCR ثبت می‌کند. این سیگنال به‌طور مستقیم با میزان DNA تکثیر شده در هر مرحله مرتبط است، بنابراین این روش به شما اجازه می‌دهد که میزان دقیق DNA یا cDNA موجود در نمونه را اندازه‌گیری کنید. Real-Time PCR به دلیل امکان اندازه‌گیری کمی و هم‌زمان به‌عنوان یک ابزار بسیار حساس و دقیق در تحقیقات ژنتیک و مطالعات بیان ژن‌ها شناخته می‌شود.

در نتیجه، RT-PCR ابتدا RNA را به cDNA تبدیل می‌کند و سپس آن را تکثیر می‌کند، در حالی که qPCR می‌تواند در زمان واقعی میزان تکثیر DNA یا cDNA را با استفاده از فلورسانس اندازه‌گیری کند، و این دو تکنیک هرکدام برای اهداف خاص و دقیق‌تری استفاده می‌شوند​.

برای مطالعه بیشتر به مقاله ذیل مراجعه فرمایید

بیشتر بخوانید:بیماری های ژنتیکی خاص؛ که با روش NIPT قابل تشخیص است!

لینک دانلود مقاله

این مقاله تحت عنوان “A Beginner’s Guide to RT-PCR, qPCR, and RT-qPCR” به بررسی و توضیح مفصل درباره تفاوت‌ها و کاربردهای این سه تکنیک در زیست‌شناسی مولکولی می‌پردازد. در ادامه خلاصه‌ای از نکات مهم مقاله ارائه می‌شود:

1. PCR و تحولات آن:

PCR (Polymerase Chain Reaction) توسط کری مولیس در سال 1985 توسعه داده شد و به سرعت تحولی عظیم در زیست‌شناسی مولکولی ایجاد کرد. این تکنیک برای تکثیر قطعات کوچک DNA استفاده می‌شود و برای بسیاری از تحقیقات و تشخیص‌ها ضروری است.

2. RT-PCR (Reverse Transcription PCR):

این روش برای تبدیل RNA به cDNA و سپس تکثیر cDNA با استفاده از PCR به کار می‌رود. RT-PCR عمدتاً برای کلونینگ مولکولی و تشخیص ویروس‌های RNA مانند SARS-CoV-2 استفاده می‌شود.

3. qPCR (Quantitative PCR):

qPCR تکنیکی است که به وسیله آن مقدار DNA در زمان واقعی (Real-Time) و با استفاده از رنگ‌های فلورسانس یا پروب‌های خاص اندازه‌گیری می‌شود. qPCR عمدتاً برای تشخیص کمی DNA، تعیین تعداد نسخه‌های DNA یا تشخیص حضور پاتوژن‌ها استفاده می‌شود.

4. RT-qPCR (Reverse Transcription Quantitative PCR):

RT-qPCR ترکیبی از RT-PCR و qPCR است و امکان اندازه‌گیری تغییرات بیان ژن از طریق RNA را فراهم می‌کند. این تکنیک برای بررسی بیان ژن‌ها و تشخیص سریع بیماری‌های ویروسی کاربرد دارد.

5. مهم‌ترین تفاوت‌ها:

• RT-PCR بیشتر برای تشخیص کیفی RNA و تکثیر cDNA به کار می‌رود.
• qPCR قابلیت کمی کردن دقیق DNA را در زمان واقعی دارد.
• RT-qPCR هر دو مرحله تبدیل RNA به cDNA و اندازه‌گیری کمی cDNA را ترکیب کرده و برای آنالیز بیان ژن‌ها استفاده می‌شود.

6. کاربردهای بالینی:

RT-qPCR به طور گسترده در تشخیص COVID-19 استفاده شده است. این تکنیک اجازه می‌دهد که تعداد زیادی از نمونه‌ها به سرعت و با دقت بالا بررسی شوند و نتایج دقیق از میزان ویروس در بیماران به دست آید.

7. تجهیزات و پروب‌ها:

پروب‌های SYBR Green و TaqMan از ابزارهای رایج در qPCR هستند که برای تشخیص دقیق محصولات PCR در طول فرآیند واکنش استفاده می‌شوند.

این مقاله نشان می‌دهد که تکنیک‌های RT-PCR، qPCR و RT-qPCR هر کدام در موارد مختلف از تحلیل بیان ژن‌ها گرفته تا تشخیص بیماری‌های ویروسی کاربرد دارند و هر کدام ویژگی‌ها و مزایای خاص خود را دارند که در تحقیقات زیست‌شناسی و کاربردهای بالینی بسیار مهم هستند.

در پایان، شرکت ماماتک همواره متعهد به ارائه فناوری‌های نوین و کارآمد در حوزه زیست‌شناسی مولکولی است. با استفاده از ابزارهای پیشرفته مانند RT-PCR، qPCR و RT-qPCR، ما به تحقیق و توسعه راهکارهای دقیق و قابل اعتماد برای تشخیص بیماری‌ها و آنالیز بیان ژن‌ها می‌پردازیم. تلاش ما این است که از طریق به‌کارگیری فناوری‌های روز و استانداردهای بین‌المللی، به بهبود سلامت عمومی و پیشبرد علم کمک کنیم. برای اطلاعات بیشتر با کارشناسان ما در تماس باشید.

ماناتک، نوآوری در خدمت دنیای مولکولی!