دیجیتال پی سی آر QIAcuity one
دیجیتال پی سی آر (Digital PCR) یک تکنولوژی مولکولی است که برای تشخیص DNA و RNA به کار میرود. در این تکنولوژی، نمونهای از DNA یا RNA مورد نظر با استفاده از آنزیمهای مولکولی مخصوصی به چندین قطعه کوچک تقسیم میشود. سپس هر یک از این قطعات در یک حجم حجیم کوچک قرار میگیرد و با استفاده از روشهای فلورسانس، تعداد کپیهای هر قطعه از DNA یا RNA را شمارش میکند.
با استفاده از تکنولوژی دیجیتال پی سی آر، میتوان به دقت بالا و با حساسیت بالا، تعداد کپیهای DNA یا RNA را اندازهگیری کرد. همچنین، این تکنولوژی به کاربر امکان میدهد تا به صورت دقیق و با کمترین خطا، تغییرات کم در تعداد کپیهای DNA یا RNA را تشخیص دهد. بنابراین، این تکنولوژی برای تشخیص بیماریهای ژنتیکی، تشخیص واکنش به درمانهای سرطانی و تشخیص ویروسهای خطرناک، بسیار مفید است.
در کل، دیجیتال پی سی آر یک تکنولوژی مولکولی حساس و دقیق است که برای تشخیص DNA و RNA به کار میرود. این تکنولوژی به کاربر امکان میدهد تا به صورت دقیق و با حساسیت بالا، تعداد کپیهای DNA یا RNA را اندازهگیری کند و برای تشخیص بیماریهای ژنتیکی و انواع سرطانها و ویروسها، بسیار مفید است.
چرا به آن PCR دیجیتال گفته میشود؟
ماهیت روشن/خاموش بودن واکنشها در dPCR آن را به یک آزمون «دیجیتال» تبدیل میکند. این مفهوم از کامپیوترهای دیجیتال گرفته شده که در آن اطلاعات به صورت صفر و یک پردازش میشود. این سادهسازی باعث میشود که دستگاه فقط دو حالت (مثبت یا منفی) را تشخیص دهد، نه یک طیف پیوسته، که در مقایسه با روشهای دیگر سادهتر و دقیقتر است.
با تحلیل تعداد واکنشهای مثبت و منفی و استفاده از آمار پواسون، تعداد مطلق مولکولهای هدف موجود در نمونه محاسبه میشود. برخلاف qPCR، dPCR نیازی به منحنیهای استاندارد برای سنجش ندارد. دقت بالای PCR دیجیتال آن را برای تشخیص رویدادهای نادر در پسزمینههای پیچیده بسیار مناسب کرده است.
دستگاه QIAcuity One از شرکت QIAGEN یک سیستم دیجیتال PCR نوین بر پایه تکنولوژی نانوپلیت است که امکان اندازهگیری دقیق و مطلق مولکولهای DNA یا RNA را فراهم میکند. برخلاف روشهای سنتی دیجیتال PCR که از قطرههای امولسیون برای تقسیم نمونه استفاده میکنند، این دستگاه از پلیتهایی با هزاران چاهک میکروسکوپی استفاده میکند که هرکدام مانند یک واکنش PCR مستقل عمل میکنند. در این سیستم، نمونه ابتدا در این چاهکها پخش میشود، سپس واکنش PCR انجام میگیرد و در پایان، با استفاده از تصویربرداری فلوئورسانس، چاهکهای مثبت و منفی شناسایی میشوند.
دستگاه با استفاده از مدل پواسون، تعداد واقعی کپیهای DNA در نمونه را بهدست میآورد. تمامی مراحل شامل پارتیشنبندی، تقویت و تحلیل سیگنالها بهصورت یکپارچه و خودکار در خود دستگاه انجام میشود و این ویژگی باعث کاهش نیاز به تجهیزات جانبی، کاهش خطر آلودگی، و سادگی کاربری میشود. سیستم نرمافزاری QIAcuity Suite همراه دستگاه، امکان تحلیل دقیق، ساخت منحنی، مقایسه نمونهها، و انجام multiplex را فراهم میکند.
این دستگاه بهطور خاص برای کاربردهایی چون تشخیص ویروسها، بررسی تغییرات کپی نامبر، شناسایی موتاسیونهای نادر، بررسی cfDNA، مطالعات اپیژنتیک و تعیین دقیق دوز ژن در تحقیقات مولکولی طراحی شده است. QIAcuity One به دلیل عملکرد سریع، دقت بالا، سادگی کاربری و طراحی بهینه برای استفاده در آزمایشگاههای پیشرفته بالینی و تحقیقاتی، یکی از دستگاههای محبوب و قابل اعتماد در حوزه dPCR محسوب میشود.
مراحل اجرای واکنش PCR دیجیتال با فناوری نانوپلیت
مرحله اول: آمادهسازی و بارگذاری
ابتدا مقدار و خلوص DNA را اندازهگیری کرده، پارامترهای دستگاه dPCR را تنظیم میکنید (مانند چرخههای حرارتی، ترکیب واکنش، چیدمان نمونهها و کنترلها). سپس مخلوط واکنش را در میکروپلیت ریخته، با فویل میپوشانید و در دستگاه قرار میدهید.
مرحله دوم: اجرای PCR و تصویربرداری
مخلوط هر چاهک به هزاران ریزواکنش تقسیم میشود. PCR در این پارتیشنها انجام شده و سیگنالهای فلورسانس توسط دوربین و نرمافزار دستگاه ثبت میگردد.
مرحله سوم: تحلیل دادهها
بسته به نوع دستگاه، میتوانید نتایج را به صورت هیتمپ، هیستوگرام یا نمودارهای پراکندگی مشاهده کنید. همچنین امکان تنظیم مجدد آستانه تشخیص و بازمحاسبه وجود دارد.
چه تست هایی را میتوان با دیجیتال PCR ران کرد؟
دیجیتال PCR (dPCR) بهواسطهی دقت بالا، حساسیت کمنظیر و توانایی اندازهگیری مطلق اسیدهای نوکلئیک، در حوزههای گوناگون زیستپزشکی، ژنتیک، تشخیص بالینی و پژوهشهای مولکولی مورد استفاده قرار میگیرد. این فناوری بهویژه در مواردی که نیاز به تشخیص مقادیر بسیار اندک، تغییرات نادر یا اندازهگیری دقیق کپینامبر وجود دارد، نسبت به روشهای پیشین برتری دارد. در ادامه، کاربردهای رایج dPCR در قالب تستهای قابل انجام با این فناوری تشریح میگردد.
یکی از مهمترین کاربردهای dPCR، تشخیص جهشهای نادر ژنی است. در بسیاری از بیماریهای ژنتیکی و بهویژه سرطان، وجود یک یا چند جهش نادر در بین حجم انبوهی از توالیهای طبیعی (Wild-type) ممکن است مسیر درمان را بهکلی تغییر دهد. دیجیتال PCR این توانایی را دارد که حتی زمانیکه درصد جهش در حد کمتر از یک درصد است، آن را با دقت بالا شناسایی کند.
بررسی و اندازهگیری تغییرات در تعداد کپی ژن (Copy Number Variation) نیز از جمله کاربردهای دقیق dPCR محسوب میشود. این ویژگی در مطالعات بیماریهای ژنتیکی، تعیین وضعیت ژنهای حساس به دوز، و ارزیابی بیان ژن در سلولهای اصلاحشده کاربرد دارد. برخلاف qPCR که وابسته به مقایسه با ژن مرجع است، dPCR میتواند تغییرات کپینامبر را بهصورت مطلق و مستقل از منحنی استاندارد ارائه دهد.
در حوزهی ویروسشناسی و تشخیص بیماریهای عفونی، dPCR برای شناسایی و کمیسازی دقیق بار ویروسی در نمونههایی نظیر پلاسما، بزاق، CSF یا بافتهای پارافینهشده مورد استفاده قرار میگیرد. برای مثال، اندازهگیری دقیق بار ویروس HPV، HBV، HCV، HIV و SARS-CoV-2 در بیماران، بهویژه در مراحل اولیه یا در موارد با بار ویروسی پایین، به کمک این روش امکانپذیر است.
در زمینهی تشخیص پیش از تولد غیرتهاجمی (NIPT)، که در آن DNA آزاد جنینی (cffDNA) از خون مادر استخراج میشود، dPCR ابزاری بسیار ارزشمند برای شناسایی آنوپلوئیدیها، جهشهای ارثی و اختلالات تکژنی محسوب میشود. این تکنیک امکان تشخیص تغییرات ژنتیکی جنین را بدون نیاز به نمونهگیری مستقیم از جنین یا جفت فراهم میسازد.
شناسایی و اندازهگیری DNA آزاد در خون (cfDNA یا ctDNA) در بیماران سرطانی نیز یکی دیگر از حوزههای پرکاربرد dPCR است. در این زمینه، dPCR قادر است جهشهای توموری را در مایع زیستی شناسایی کرده و برای پایش پاسخ به درمان، تشخیص بازگشت بیماری، یا حتی شناسایی اولیهی سرطان مورد استفاده قرار گیرد.
از دیگر تستهای قابل انجام با dPCR میتوان به اندازهگیری میزان وکتورهای ویروسی در ژندرمانی، بررسی آلودگیهای ژنتیکی در فرآیندهای تولید زیستی، شناسایی پاتوژنهای گیاهی، و تعیین بیان ژن در تحقیقات پایه اشاره کرد. همچنین، در زمینهی مهندسی ژنتیک، بهویژه هنگام ارزیابی سلولهای دستکاریشده نظیر سلولهای CAR-T، تعیین دوز دقیق ژن تزریقی با کمک dPCR انجام میپذیرد.
در مجموع، گسترهی کاربردهای دیجیتال PCR از مرزهای آزمایشگاهی فراتر رفته و به ابزاری حیاتی در پزشکی دقیق، غربالگری ژنتیکی، و پژوهشهای مولکولی بدل شده است. این فناوری، بهواسطهی توانایی در شناسایی دقیق، حساسیت بالا و استقلال از عوامل متغیر واکنش، نقشی اساسی در آیندهی تشخیصهای مولکولی ایفا خواهد کرد.
دیجیتال PCR و نقش بسزای آن در تشخیص سرطان
در حوزهی سرطانشناسی، دیجیتال PCR (dPCR) بهعنوان ابزاری قدرتمند در اختیار پزشکان و پژوهشگران قرار گرفته است تا با دقتی بینظیر، تغییرات ژنتیکی مرتبط با سرطان را شناسایی، کمیسازی و پایش نمایند. کاربردهای این فناوری در تستهای مرتبط با سرطان بسیار متنوع و روبهگسترش است، چراکه بسیاری از این تستها نیازمند شناسایی جهشهایی هستند که در میان مقادیر زیادی از توالیهای طبیعی پنهان شدهاند، یا آنکه در نمونههای مایع بدن به مقدار بسیار اندک وجود دارند.
یکی از مهمترین کاربردهای dPCR در این زمینه، شناسایی جهشهای خاص در cfDNA یا ctDNA است؛ مولکولهای DNA آزادشده از سلولهای توموری در جریان خون. این DNA، که بهعنوان نشانگر زیستی غیرتهاجمی در سرطان شناخته میشود، بهویژه در مواردی که نمونهبرداری از تومور امکانپذیر نیست یا خطرناک تلقی میشود، اهمیت دوچندان مییابد. dPCR با حساسیت بالا و توانایی تشخیص جهشهایی با فراوانی کمتر از ۰/۱ درصد، ابزار ارزشمندی برای غربالگری و شناسایی زودهنگام سرطان محسوب میشود.
در بسیاری از سرطانها، از جمله سرطان ریه، پستان، تخمدان، کولون و ملانوم، بررسی وجود یا عدم وجود جهشهایی در ژنهایی مانند EGFR، KRAS، BRAF، PIK3CA، و TP53، به تعیین مسیر درمانی کمک میکند. بهعنوان مثال، در سرطان ریه، شناسایی جهشهای خاص در ژن EGFR میتواند استفاده از داروهای مهارکنندهی تیروزینکیناز (TKI) را تجویز یا رد کند. در چنین شرایطی، dPCR قادر است این جهشها را حتی زمانیکه در مقادیر بسیار اندک در نمونهی خون بیمار وجود دارند، شناسایی نماید.
از دیگر کاربردهای dPCR در سرطانشناسی میتوان به پایش بیماری در حین درمان (Monitoring) اشاره کرد. با اندازهگیری دینامیک cfDNA حاوی جهشهای توموری، میتوان اثربخشی درمان را در زمان واقعی ارزیابی کرد و در صورت بازگشت بیماری یا مقاوم شدن تومور به درمان، اقدام به تغییر رویکرد درمانی نمود.
همچنین در زمینهی بررسی مینیمال باقیماندهی بیماری (MRD)، که هدف آن تشخیص سلولهای سرطانی باقیمانده پس از درمان است، dPCR ابزاری حیاتی محسوب میشود. در برخی سرطانهای هماتولوژیک، مانند لوسمی یا لنفوم، تعیین وجود ژنهای فیوژن یا جهشهای خاص در سطح بسیار پایین میتواند پیشبینیکنندهی عود بیماری باشد.
علاوه بر آن، در بررسی تغییرات کپینامبر ژنها (CNV) و ناپایداری ژنتیکی در تومورها، dPCR توانایی کمّیسازی دقیق تعداد کپیهای یک ژن در سلولهای توموری را داراست؛ مسئلهای که در برخی از سرطانها با پیامدهای پیشآگهی یا درمانی همراه است.
در نهایت، استفاده از dPCR در مطالعات پژوهشی مرتبط با سرطان نیز رو به گسترش است؛ از بررسی متیلاسیون DNA در پروموتر ژنهای سرکوبگر تومور گرفته تا بررسی بیان ژنهای خاص در تومورهای جامد یا بافتهای پاتولوژیک.
بدینترتیب، دیجیتال PCR با حساسیت بالا، قابلیت شناسایی جهشهای نادر، امکان تحلیل غیرتهاجمی نمونههای مایع، و توانایی در رصد تحولات مولکولی تومورها، به ابزاری حیاتی در تشخیص، درمان و پایش سرطان تبدیل شده است؛ ابزاری که جایگاه آن در پزشکی دقیق آینده روزبهروز برجستهتر میشود.
پنل های کنسری متفاوتی را میشه با دستگاه دیجیتالPCR بررسی کرد که در ادامه نام برده میشود.
سرطان کلورکتال:
سرطان کولورکتال به سرطانهایی اطلاق میشود که در روده بزرگ یا راست روده شروع میشوند. این نوع سرطان معمولاً از رشد غیرعادی سلولها در بافت روده شروع میشود و به شکل پولیپهای سرطانی دیده میشود که ممکن است به دیگر قسمتهای بدن گسترش یابد. عواملی مانند سن، تاریخچه خانوادگی، تغذیه نامناسب و بیماریهای التهابی روده میتوانند خطر ابتلا به سرطان کولورکتال را افزایش دهند. برای بررسی این سرطان میتوان 3 فاکتور را بررسی کرد که شامل:
Colorectal Cancer Mutation Screening: این تست برای شناسایی جهشهای مرتبط با سرطان کولورکتال طراحی شده است. با استفاده از فناوری دیجیتال PCR (dPCR) قادر هستید ۱۲۲ نقطه جهشی مختلف را در چهار گروه ژنی شناسایی کنید.
Colorectal Cancer Panel Sequencing Library Preparation : برای تهیهی کتابخانههای توالییابی نسل جدید (NGS) بکار میرود .این تست بهطور خاص برای شناسایی جهشهای مرتبط با سرطان کولورکتال در ۲۱ ژن کلیدی مرتبط با این بیماری توسعه یافته است.
APC Multiplex Mutation Screening: برای شناسایی جهشهای ژن APC طراحی شده است. این ژن بهعنوان یک ژن سرکوبگر تومور شناخته میشود و نقش مهمی در تنظیم رشد سلولی دارد. جهشهای غیرکارکردی در ژن APC معمولاً در مراحل اولیهی سرطان کولورکتال (CRC) رخ میدهند و بهویژه در بیماران مبتلا به پلیپوز آدنوماتوز خانوادگی (FAP) مشاهده میشوند.
HPV:
HPV با نفوذ به سلولهای اپیتلیالی و تولید پروتئینهای E6 و E7 باعث اختلال عملکرد ژنهای سرکوبگر تومور مانند p53 و Rb میشود.
این تغییرات منجر به رشد غیرعادی و تکثیر بیقاعده سلولها و ایجاد ناپایداری ژنتیکی میشود.
در نتیجه، عفونت مداوم HPV میتواند زمینه ایجاد سرطانهایی مانند سرطان دهانه رحم، مقعد و سر و گردن را فراهم کند. برای بررسی سرطان های ناشی از ویروس HPV میتوان پنل های سرطانی مختلفی را بررسی کرد که در ادامه به معرفی آن میپردازیم:
AmpFire HPV Screening 16/18/HR: یک آزمون تقویت اسید نوکلئیک ایزوترمال است که برای شناسایی کیفی DNA ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) با ریسک بالا طراحی شده است. با استفاده از پرایمرها و پروبهای فلورسانس خاص، نواحی ژنومی ویروس، از جمله نواحی E6/E7، را تحت شرایط ایزوترمال تقویت میکند.
ScreenFire HPV RS: آزمون تقویت اسید نوکلئیک ایزوترمال است که برای شناسایی کیفی DNA ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) با ریسک بالا طراحی شده است که با استفاده از پرایمرها و پروبهای فلورسانس خاص، نواحی ژنومی ویروس، از جمله نواحی E6/E7، را تحت شرایط ایزوترمال تقویت میکند.
AmpFire HPV High-Risk Genotyping: آزمون تقویت اسید نوکلئیک ایزوترمال با تشخیص فلورسانس در زمان واقعی است که برای تعیین ژنوتیپ کیفی ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) با ریسک بالا طراحی شده است. این تست قادر است ۱۵ ژنوتیپ HPV با ریسک بالا را بهطور جداگانه شناسایی کند، از جمله: HPV16، HPV18، HPV31، HPV33، HPV35، HPV39، HPV45، HPV51، HPV52، HPV53، HPV56، HPV58، HPV59، HPV66 و HPV68.
Hotspot Sequencing:
Hotspot sequencing، روشی هدفمند برای بررسی نواحی پرتغییر در ژنوم است.
این روش با بهرهگیری از فناوریهای نوین توالییابی، امکان شناسایی دقیق جهشهای کلینیکی را فراهم میکند.
نتایج آن در تشخیص سریعتر و دقیقتر بیماریهای ژنتیکی و سرطان نقش بسزایی دارد. برای بررسی آن میتوان از پنل تشخیصی Hotspot Cancer Panel Sequencing Library Preparation استفاده کرد.
Lung Cancer:
سرطان ریه عمدتاً به دستههای سلول کوچک و غیر سلول کوچک تقسیم میشود و از تجمع سلولهای غیرطبیعی در بافت ریه ناشی میشود. برای تشخیص این نوع سرطان میتوان از پنل های تشخیصی متفاوتی استفاده کرد که شامل:
dPCR Lung Cancer Mutation Screening: برای شناسایی جهشهای مرتبط با سرطان ریه غیر سلول کوچک (NSCLC) طراحی شده است. با استفاده از فناوری دیجیتال PCR (dPCR) میتوان ۱۰۸ نقطه جهشی مختلف را در چهار گروه ژنی شناسایی کرد.
Lung Cancer Panel Sequencing Library Preparation: برای تهیهی کتابخانههای توالییابی نسل جدید (NGS) طراحی شده است. بهطور خاص برای شناسایی جهشهای مرتبط با سرطان ریه توسعه یافته است.
Multiplex Mutation Screening:
Multiplex Mutation Screening با استفاده از یک واکنش آزمایشگاهی، چندین جهش ژنتیکی را بهصورت همزمان در یک نمونه شناسایی میکند. این روش با بهرهگیری از فناوریهای پیشرفته مانند digital PCR یا NGS، امکان غربالگری سریع و دقیق جهشها را فراهم میکند.
در ادامه به پنل های سرطانی اختصاصی برای این روش اشاره خواهیم کرد.
TP53 Multiplex Mutation Screening: روشی پیشرفته برای شناسایی جهشهای ژن TP53 با استفاده از فناوری دیجیتال PCR (dPCR) است. در این روش شناسایی ۲۹۵ نقطه جهشی در ژن TP53 در یک واکنش منفرد، که امکان تحلیل دقیقتر و تصمیمگیری بالینی مؤثرتر را فراهم میکند.
BRAF Multiplex Mutation Screening: برای شناسایی جهشهای ژن BRAF با استفاده از فناوری دیجیتال PCR (dPCR) است. در این روش شناسایی ۶۲ نقطه جهشی در ژن BRAF در یک واکنش منفرد، که امکان تحلیل دقیقتر و تصمیمگیری بالینی مؤثرتر را فراهم میکند.
EGFR Multiplex Mutation Screening: شناسایی ۶۴ نقطه جهشی در ژن EGFR در یک واکنش منفرد، از جمله جهشهای G719X، حذفهای Ex19Del، S768I، درجهای Ex20Ins، T790M، L858R و L861Q.
HER2 Multiplex Mutation Screening: شناسایی ۱۸ نقطه جهشی در ژن HER2 در یک واکنش منفرد، از جمله جهشهای p.G776>VC، p.P780_Y781insGSP، p.V777_G778insCG، p.L755S و p.V777L.
KRAS Multiplex Mutation Screening: برای شناسایی همزمان ۶۱ نقطه جهشی در ژن KRAS است.این روش با استفاده از فناوری دیجیتال PCR (dPCR) طراحی شده و امکان غربالگری دقیق و حساس جهشهای رایج در اگزونهای ۲، ۳ و ۴ ژن KRAS را فراهم میکند.
NRAS Multiplex Mutation Screening: برای شناسایی همزمان ۳۵ نقطه جهشی در ژن NRAS با استفاده از فناوری دیجیتال PCR (dPCR) است. این روش برای تشخیص جهشهای رایج در اگزونهای ۲، ۳ و ۴ ژن NRAS طراحی شده است.
PIK3CA Multiplex Mutation Screening: برای شناسایی همزمان ۴۰ نقطه جهشی در ژن PIK3CA با استفاده از فناوری دیجیتال PCR (dPCR) است. این روش برای تشخیص جهشهای رایج در اگزونهای ۵، ۷، 9، 20 و 21 ژن PIK3CA طراحی شده است.
RET/MET Multiplex Mutation Screening: شناسایی تا ۱۱ نقطه جهشی در ژنهای RET و MET در یک واکنش منفرد.
نمونههایی از مقالات علمی برجسته در زمینه dPCR:
-
Amman و همکاران، 2022، Nature Biotechnology: تعیین بار ویروسی SARS-CoV-2 در فاضلاب
-
LaPierre و همکاران، 2022، Nature Communications: سنجش ژنهای تنظیمکننده انرژی در پستانداران
-
Toffoli و همکاران، 2022، Communications Biology: بررسی واریانتهای GBA در بیماران پارکینسون
-
Tergemina و همکاران، 2022، Science Advances: تحلیل بیان و تعداد نسخه NRAMP1 در گیاه Arabidopsis
-
Luo و همکاران، 2020، Science Advances: سنجش طول مطلق تلومرها با روش STAR مبتنی بر dPCR
برای دسترسی به مقالات بیشتر در زمینه dPCR، میتوانید به وبلاگهای تخصصی و منابع علمی مرتبط مراجعه کنید.
تحلیل نهایی:
روش دیجیتال PCR به دلیل حساسیت بالا، توانایی شناسایی جهشهای نادر و ارائه کمّی مطلق، ابزاری کارآمد برای تشخیص پنلهای سرطانی محسوب میشود. این فناوری امکان غربالگری همزمان چندین ژن مرتبط با سرطان را در یک واکنش فراهم کرده، تشخیص و پایش بیماری را تسهیل میکند.
استفاده از دیجیتال PCR در پنلهای سرطانی، سرعت و دقت بالای تشخیص را تضمین کرده و به تصمیمگیری بالینی دقیق کمک مینماید. در نهایت، این روش نقشی اساسی در پیشرفت تشخیصهای مولکولی و بهبود نتایج درمانی بیماران سرطانی ایفا میکند.
دیدگاهها
هیچ دیدگاهی برای این محصول نوشته نشده است.