انواع روش‌های استخراج DNA و RNA از ویروس

مقدمه

استخراج DNA و RNA از ویروس‌ها یکی از مراحل حیاتی در تحقیقات مولکولی، ویروس‌شناسی، تشخیص بیماری‌ها و توسعه درمان‌های ضدویروسی است. این مرحله به طور مستقیم روی کیفیت و اعتبار نتایج آزمایش‌های PCR، Real-Time PCR، توالی‌یابی نسل جدید (NGS) و آنالیز ژنومی تأثیر می‌گذارد. کیفیت پایین یا تخریب اسید نوکلئیک می‌تواند باعث نتایج نادرست، از دست رفتن نمونه‌های ارزشمند و حتی تصمیمات بالینی غلط شود. ویروس‌ها به دو دسته DNA و RNA تقسیم می‌شوند و هر نوع ژنوم نیازمند پروتکل‌های خاص برای استخراج است، زیرا ویژگی‌های ساختاری، پوشش پروتئینی یا لیپیدی و حساسیت آن‌ها نسبت به تخریب متفاوت است.

ویروس‌های DNA به دلیل ساختار پایدارتر، نسبتاً ساده‌تر استخراج می‌شوند، اما همچنان چالش‌هایی دارند. ویروس‌های RNA به دلیل ناپایداری ذاتی و حساسیت به RNaseها، نیازمند دقت بالا، استفاده از بافرهای محافظ و پروتکل‌های سریع و استاندارد هستند. انتخاب روش مناسب استخراج به نوع ویروس، نمونه، هدف آزمایش و شرایط آزمایشگاه بستگی دارد.

۱. استخراج DNA ویروسی

استخراج DNA از ویروس‌ها یکی از مراحل پایه و حیاتی در ویروس‌شناسی، تشخیص مولکولی و پژوهش‌های ژنتیکی است. کیفیت DNA استخراج شده تأثیر مستقیم روی حساسیت و دقت آزمایش‌های بعدی مانند PCR، Real-Time PCR و توالی‌یابی نسل جدید (NGS) دارد. DNA ویروسی نسبت به RNA پایدارتر است، اما شرایط نامناسب نگهداری، حضور DNase و مراحل نادرست استخراج می‌توانند باعث تخریب آن شوند.

ویروس‌ها بسته به نوع ژنوم (DNA تک‌رشته‌ای یا دو‌رشته‌ای، پوشش‌دار یا بدون پوشش) نیازمند پروتکل‌های متفاوت هستند. به طور کلی، استخراج DNA ویروسی شامل مراحل زیر است:

1. لیز ویروس: آزادسازی DNA از کپسید یا پوشش ویروس با استفاده از بافرهای شیمیایی یا ترکیبی از روش‌های مکانیکی و شیمیایی.

2. حذف پروتئین‌ها و ناخالصی‌ها: استفاده از پروتئینازها، بافرهای شست‌وشو یا فنول/کلروفرم برای حذف پروتئین‌ها، لیپیدها و سایر مواد مزاحم.

3. جمع‌آوری DNA: جذب DNA به ستون سیلیکا یا رسوب‌دهی با اتانول/ایزوپروپانول و شست‌وشوی آن برای خالص‌سازی.

4. الوشن (Elution): جمع‌آوری DNA خالص در بافر مناسب برای استفاده در آزمایش‌های بعدی.

روش‌های استخراج DNA ویروسی

۱.۱ روش مبتنی بر ستون سیلیکا

روش ستون سیلیکا یکی از رایج‌ترین و استانداردترین روش‌ها برای استخراج DNA است و اساس آن جذب DNA به سطح سیلیکا در حضور نمک‌های خاص است. مراحل کلی شامل لیز نمونه، جذب DNA به ستون، شست‌وشوی چندمرحله‌ای برای حذف پروتئین‌ها و لیپیدها و در نهایت elution DNA خالص است. این روش برای نمونه‌هایی با غلظت متوسط تا بالا مناسب است و تولید DNA با خلوص بالا و کاهش خطر آلودگی را فراهم می‌کند. با این حال، هزینه نسبتاً بالا و کاهش بازده در نمونه‌های با غلظت پایین DNA از محدودیت‌های آن است. مثال عملی: برای تشخیص ویروس هپاتیت B در پلاسما، ستون سیلیکا روش مطمئن و سریع محسوب می‌شود و نمونه آماده برای PCR یا NGS خواهد بود.

۱.۲ روش شیمیایی با فنول/کلروفرم

این روش سنتی و دقیق DNA را با جداسازی فاز آبی از فاز آلی جمع‌آوری می‌کند. نمونه با فنول و کلروفرم مخلوط شده، سپس با سانتریفیوژ فازها تفکیک می‌شوند و DNA از فاز آبی جمع‌آوری و با اتانول یا ایزوپروپانول رسوب داده می‌شود. این روش بازده بالایی دارد، حتی در نمونه‌های کم یا پیچیده، اما زمان‌بر است و نیازمند مهارت بالای آزمایشگاهی و رعایت نکات ایمنی به دلیل سمی بودن فنول و کلروفرم است. مثال عملی: برای مطالعات ژنتیکی ویروس‌های غیرمتداول یا نمونه‌های محیطی با DNA پایین، این روش بازده بالاتری نسبت به ستون سیلیکا دارد.

۱.۳ روش‌های ترکیبی و کیت‌های تجاری

روش‌های ترکیبی معمولاً ستون سیلیکا و مراحل شیمیایی را با هم تلفیق می‌کنند تا بازده و خلوص DNA افزایش یابد. کیت‌های تجاری با استانداردسازی مراحل و کاهش زمان کار، reproducibility بالا و سادگی استفاده را فراهم می‌کنند. مثال عملی: کیت‌های استخراج DNA ویروسی برای تشخیص سریع هپاتیت B یا HPV در آزمایشگاه‌های بالینی استفاده می‌شوند و نمونه آماده برای PCR یا NGS است.

۲. استخراج RNA ویروسی

استخراج RNA ویروسی یکی از حساس‌ترین و حیاتی‌ترین مراحل در ویروس‌شناسی، تشخیص مولکولی و پژوهش‌های ژنتیکی است، زیرا RNA ویروس‌ها به شدت ناپایدار هستند و هرگونه تماس با RNase یا شرایط نامناسب می‌تواند منجر به تخریب آن‌ها شود. این فرآیند پایه و اساس آزمایش‌هایی مانند RT-PCR، Real-Time PCR و توالی‌یابی نسل جدید (NGS) است و موفقیت یا شکست آزمایش‌های بعدی به کیفیت RNA استخراج شده بستگی دارد. نمونه‌های ویروسی شامل سرم، پلاسما، سواب بینی و گلو، بافت‌ها یا نمونه‌های محیطی هستند و استخراج RNA باید به گونه‌ای انجام شود که حداکثر بازده و خلوص حاصل شود.

فرآیند استخراج RNA ویروسی از چند مرحله اصلی تشکیل می‌شود. ابتدا نمونه باید به دقت جمع‌آوری و در دمای مناسب ذخیره شود تا RNA تخریب نشود. سپس ویروس با استفاده از بافرهای لیز که شامل عوامل بازدارنده RNase هستند، شکسته می‌شود و RNA آزاد می‌شود. در مرحله بعد، پروتئین‌ها، لیپیدها و سایر ناخالصی‌ها با استفاده از پروتئینازها یا روش‌های شیمیایی مانند فنول/کلروفرم حذف می‌شوند تا RNA خالص باقی بماند. پس از این مرحله، RNA خالص یا به ستون سیلیکا جذب می‌شود و یا با روش‌های رسوب‌دهی الکلی جمع‌آوری می‌گردد و با شست‌وشوی چندمرحله‌ای ناخالصی‌های باقی‌مانده حذف می‌شوند. در نهایت RNA خالص با یک بافر مناسب elute می‌شود تا آماده استفاده در آزمایش‌های مولکولی باشد.

روش‌های استخراج RNA ویروسی شامل سه دسته اصلی است: روش مبتنی بر ستون سیلیکا، روش شیمیایی با فنول/کلروفرم و کیت‌های تجاری یا روش‌های ترکیبی. در روش ستون سیلیکا، RNA در حضور بافرهای محافظ به ستون سیلیکا جذب می‌شود و پس از شست‌وشوی چند مرحله‌ای RNA خالص elute می‌شود. این روش مزایایی مانند سرعت بالا، کاهش تخریب RNA و کاهش خطر آلودگی نمونه دارد، اما در نمونه‌هایی با RNA بسیار کم بازده پایین‌تری دارد. مثال عملی آن استخراج RNA ویروس SARS-CoV-2 از سواب بینی بیمار برای RT-PCR و توالی‌یابی است.

۲.۱ روش مبتنی بر ستون سیلیکا

در این روش، نمونه با بافرهای محافظ RNA و حذف RNase لیز می‌شود. RNA به ستون سیلیکا جذب و با شست‌وشوی چندمرحله‌ای ناخالصی‌ها حذف می‌شوند و RNA خالص elute می‌شود. مزیت اصلی این روش سرعت بالا و کاهش تخریب RNA است، اما بازده در نمونه‌های با RNA بسیار کم ممکن است کاهش یابد. مثال عملی: استخراج RNA ویروس SARS-CoV-2 از سواب بینی بیمار برای RT-PCR تشخیصی با این روش انجام می‌شود و نمونه آماده تحلیل مستقیم است.

۲.۲ روش شیمیایی با فنول/کلروفرم

در این روش، RNA با فنول/کلروفرم و رسوب‌دهی با اتانول یا ایزوپروپانول جدا می‌شود. این روش برای نمونه‌هایی با RNA کم یا پیچیده مناسب است و بازده بالایی دارد، اما نیازمند مهارت بالا، دقت و رعایت نکات ایمنی است. مثال عملی: مطالعات تحقیقاتی روی ویروس‌های RNA با غلظت پایین یا نمونه‌های محیطی با این روش بازده خوبی دارند.

۲.۳ کیت‌های تجاری و روش‌های ترکیبی

کیت‌های تجاری برای RNA معمولاً ترکیبی از لیز شیمیایی، جذب RNA به ستون سیلیکا و شست‌وشوی چندمرحله‌ای هستند. مزیت اصلی آن‌ها کاهش زمان، افزایش reproducibility و آماده بودن RNA برای استفاده مستقیم در RT-PCR یا NGS است. مثال عملی: تشخیص سریع آنفلوآنزا یا HIV در آزمایشگاه‌های بالینی با این کیت‌ها انجام می‌شود و نتیجه سریع و قابل اعتماد است.

۳. انتخاب روش مناسب

انتخاب بهترین روش استخراج DNA یا RNA ویروسی به عوامل متعددی بستگی دارد. نوع ویروس، به‌ویژه پوشش لیپیدی یا غیرلیپیدی، تعیین می‌کند که چه بافرها و شرایطی لازم است. نوع نمونه نیز اهمیت دارد؛ نمونه‌های بافتی ممکن است نیازمند لیز مکانیکی و شیمیایی ترکیبی باشند، در حالی که نمونه‌های سرم یا پلاسما پروتکل ساده‌تر را می‌پذیرند. هدف آزمایش نیز تعیین‌کننده روش است؛ برای تشخیص سریع، ستون سیلیکا مناسب است، اما برای تحقیقات ژنتیکی عمیق یا توالی‌یابی، روش‌های شیمیایی یا ترکیبی بهترند. حجم و کیفیت نمونه نیز تأثیر مستقیم روی بازده دارد، زیرا نمونه‌های کم یا با غلظت پایین DNA یا RNA نیازمند روش‌های حساس و دقیق هستند.

۴. چالش‌ها و محدودیت‌ها

استخراج DNA و RNA ویروسی با چالش‌هایی همراه است. آلودگی نمونه توسط DNA یا RNA میزبان، RNaseها و پروتئین‌های مزاحم می‌تواند کیفیت استخراج را کاهش دهد. RNA ویروس‌ها به دلیل ناپایداری شدید، تخریب سریع دارند و هرگونه تأخیر یا شرایط نامناسب باعث از بین رفتن آن‌ها می‌شود. نمونه‌های با حجم کم یا غلظت پایین نیز بازده را کاهش می‌دهند. تجهیزات و کیت‌های پیشرفته هزینه بالایی دارند و اجرای پروتکل دقیق نیازمند تخصص و مهارت بالای آزمایشگاهی است. تفاوت بین کیت‌ها و پروتکل‌ها نیز باعث ناهمسانی نتایج بین آزمایشگاه‌ها می‌شود.

جدول مقایسه روش‌ها

۵. روندها و چشم‌انداز آینده

استخراج DNA و RNA ویروسی نقش بنیادی در تشخیص بیماری‌ها، پژوهش‌های ژنتیکی و توسعه درمان‌های ضدویروسی دارد و با پیشرفت فناوری‌های مولکولی، روندها و چشم‌انداز آینده این حوزه در حال تحول است. یکی از مهم‌ترین روندها اتوماسیون کامل فرآیند استخراج است. با استفاده از دستگاه‌های اتوماتیک، نمونه‌ها بدون دخالت دست پردازش می‌شوند، که باعث کاهش خطای انسانی، افزایش reproducibility و استانداردسازی نتایج در آزمایشگاه‌ها می‌شود. این اتوماسیون همچنین زمان کار را کاهش می‌دهد و امکان پردازش حجم بالایی از نمونه‌ها را فراهم می‌کند، که در دوران پاندمی‌ها یا در آزمایشگاه‌های تشخیصی با حجم بالای نمونه بسیار حیاتی است.

روند دیگر استخراج همزمان DNA و RNA از یک نمونه واحد است. این روش‌ها امکان جمع‌آوری هر دو نوع اسید نوکلئیک را در یک فرآیند فراهم می‌کنند و نیاز به نمونه‌های بیشتر یا پروتکل‌های جداگانه را کاهش می‌دهند. چنین رویکردی به ویژه در مطالعات مولکولی پیشرفته، توالی‌یابی ژنوم کامل ویروس و تحقیقات اپی‌ژنتیک اهمیت دارد. به کمک این تکنولوژی، پژوهشگران می‌توانند همزمان ژنوم ویروس را تحلیل کرده و بررسی تغییرات RNA ویروسی یا الگوهای بیان ژن را انجام دهند.

روش‌های غیرتهاجمی جمع‌آوری نمونه نیز از دیگر روندهای آینده هستند. توسعه سواب‌های محیطی، نمونه‌های بزاق و مایعات بدن که نیاز به فرآیند تهاجمی ندارند، باعث راحتی بیمار، کاهش خطر آلودگی و دسترسی آسان به نمونه‌ها می‌شوند. این روند با تکنیک‌های استخراج RNA حساس و سریع ترکیب می‌شود تا حتی از نمونه‌های با حجم کم یا غلظت پایین RNA نیز نتایج دقیق به دست آید.

با پیشرفت کیت‌ها و روش‌های استخراج، کاهش هزینه و دسترسی آسان به تجهیزات و کیت‌ها نیز چشم‌انداز مهمی است. این روند به آزمایشگاه‌های کوچک و کشورهایی که منابع محدودی دارند، اجازه می‌دهد تا با استانداردهای جهانی، تشخیص مولکولی دقیق و مطالعات تحقیقاتی را انجام دهند. علاوه بر این، تولید کیت‌های چندمنظوره و استاندارد، reproducibility بین آزمایشگاه‌ها را افزایش می‌دهد و نتایج قابل اعتمادتر می‌شوند.

همچنین، هماهنگی کامل استخراج DNA و RNA با NGS، RT-PCR و دیگر تکنولوژی‌های مولکولی پیشرفته از دیگر چشم‌اندازهای مهم است. RNA و DNA خالص و با کیفیت بالا امکان توالی‌یابی دقیق، شناسایی جهش‌های ویروسی، بررسی اپی‌ژنتیک و تحقیقات تک‌سلولی را فراهم می‌کند. با پیشرفت این تکنولوژی‌ها، پژوهشگران می‌توانند سرعت تحلیل ویروس‌ها را افزایش داده، داده‌های ژنتیکی دقیق‌تری به دست آورند و واکنش سریع‌تری در برابر اپیدمی‌ها داشته باشند.

در نهایت، پایداری و حفاظت از نمونه‌ها نیز یکی دیگر از حوزه‌های توسعه است. بافرهای محافظ جدید، شرایط ذخیره‌سازی بهینه و فناوری‌های جدید تثبیت RNA و DNA، احتمال تخریب نمونه را کاهش می‌دهند و امکان نگهداری طولانی‌مدت نمونه‌ها برای مطالعات بین‌المللی و ذخیره‌سازی آرشیوی را فراهم می‌کنند. این روند، ترکیب سرعت، دقت و ایمنی را در استخراج اسید نوکلئیک ویروسی به سطح بالاتری می‌رساند.

به طور خلاصه، چشم‌انداز آینده استخراج DNA و RNA ویروسی شامل اتوماسیون، استخراج همزمان، روش‌های غیرتهاجمی، کاهش هزینه، هماهنگی با تکنولوژی‌های پیشرفته، و پایداری نمونه‌ها است. این تحولات، توانایی پژوهشگران و پزشکان را در تشخیص، مطالعه و درمان بیماری‌های ویروسی به شکل قابل توجهی افزایش می‌دهند و به توسعه سریع‌تر علم ویروس‌شناسی و پزشکی مولکولی کمک می‌کنند.