چگونه یک ترموسایکلر را کالیبره کنیم؟
با افزایش نیاز به کالیبراسیون ترموسایکلرها، تعداد فزاینده‌ای از گروه‌ها دیدگاه‌هایی در مورد نحوه کالیبراسیون ترموسایکلر دارند. این دیدگاه‌ها از “دیدگاه زیست‌شناس مولکولی” مبنی بر تقلید فرآیند PCR تا “دیدگاه متروژیست” برای کالیبراسیون به روشی تعریف‌شده و قابل ردیابی توسط پرسنل مجرب، در شرایط محیطی تعریف‌شده، با کمترین عدم قطعیت ممکن در اندازه‌گیری، متغیر هستند. در پاراگراف‌های زیر، مزایا و معایب دیدگاه‌های مختلف مورد بحث قرار می‌گیرند و توصیف می‌شود که کدام روش کالیبراسیون ترموسایکلر از همه مطمئن‌تر است.
فهرست مطالب
- 1 کالیبراسیون با تقلید فرآیند PCR
- 2 کالیبراسیونی که نمایانگر فرآیند باشد
- 3 کالیبراسیون مطابق با استانداردهای بین‌المللی
- 4 مطمئن‌ترین روش کالیبراسیون یک ترموسایکلر
- 5 ۱. کالیبراسیون دمایی:
- 6 ۲. کالیبراسیون سنسورهای دما:
- 7 ۳. تست عملکردی:
- 8 ۴. نگهداری و تمیز کردن:
- 9 شباهت‌ها:
- 10 تفاوت‌ها:
- 11 نکته مهم:
- 12 تست عملکردی
- 13 نگهداری و تمیز کردن
کالیبراسیون با تقلید فرآیند PCR
از دیدگاه زیست‌شناس مولکولی، بهترین روش برای کالیبراسیون یک ترموسایکلر، تقلید فرآیند PCR است. به عبارت دیگر، قرار دادن لوله‌ها در تمام چاهک‌های بلوک، پر کردن آنها با مخلوط واکنش و قرار دادن سنسورها در داخل لوله‌ها، بستن درپوش لوله‌ها، بستن درپوش گرم ترموسایکلر و اجرای پروتکل PCR به‌طور معمول در آزمایشگاه انجام می‌شود. این روش تا حد امکان نزدیک به دمای واقعی داخل یک لوله خاص، پر شده با مخلوط واکنش خاص، در طول یک پروتکل PCR خاص، در یک دستگاه خاص خواهد بود. اما همان‌طور که از عبارت‌بندی نشان داده می‌شود، این روش نمی‌تواند به‌صورت استاندارد مورد استفاده قرار گیرد. برای هر ترکیب لوله، مخلوط، پروتکل و دستگاه، باید این “کالیبراسیون” تکرار شود که نیاز به کار بسیار زیادی دارد و نتایجی تولید می‌کند که نمی‌توان آنها را با یکدیگر مقایسه کرد یا به هیچ‌گونه استانداردی یا مشخصات سازنده ترموسایکلر نسبت داد. علاوه بر این، این روش “کالیبراسیون” متغیرهای زیادی را معرفی می‌کند که کنترل نشده‌اند و بنابراین یک جزء بزرگ به عدم قطعیت اندازه‌گیری اضافه می‌کند که در نهایت به عدم قطعیت بیش از 2 درجه سانتی‌گراد می‌انجامد. به‌طور عملی، وقتی عدم قطعیت مثلاً 2 درجه سانتی‌گراد باشد، در حالی که دمای اندازه‌گیری 96 درجه سانتی‌گراد است، دمای ترموسایکلر می‌تواند بین 94 درجه سانتی‌گراد و 98 درجه سانتی‌گراد باشد. همان‌طور که در پاراگراف 3.2 توضیح داده شد، این تفاوت دما تأثیرات چشمگیری بر غیرفعال‌سازی Taq پلیمراز دارد. بنابراین این سطح از عدم قطعیت برای کالیبراسیون ترموسایکلر قابل قبول نیست، اگرچه تقلید فرآیند PCR ممکن است یک انتخاب ساده و جذاب به نظر برسد.
کالیبراسیونی که نمایانگر فرآیند باشد
از دیدگاه شیمی‌دان بالینی، بهترین روش برای کالیبراسیون یک ترموسایکلر، اندازه‌گیری به روشی استاندارد شده و نمایانگر فرآیند PCR است. این روش استاندارد شده به یک کالیبراسیون برای همه انواع مختلف PCRها اجازه می‌دهد و همچنین امکان مقایسه با یک استاندارد را فراهم می‌کند. برای اینکه یک کالیبراسیون نمایانگر فرآیند PCR باشد، باید هم قسمت دینامیک و هم قسمت استاتیک فرآیند PCR را در نظر بگیرد، زیرا برخی مشکلات فقط با بررسی قسمت استاتیک PCR قابل تشخیص نیستند. علاوه بر این، تعدادی دمای مختلف، ترجیحاً نزدیک به دماهای دناتوراسیون، آنیلینگ و افزایش طول، باید ارزیابی شوند زیرا اثرات می‌توانند با دما تغییر کنند.
کالیبراسیون مطابق با استانداردهای بین‌المللی
از دیدگاه متروژیست، بهترین روش برای کالیبراسیون یک ترموسایکلر، اندازه‌گیری به روشی تعریف‌شده و قابل ردیابی توسط پرسنل مجرب، در شرایط محیطی تعریف‌شده، با کمترین عدم قطعیت ممکن در اندازه‌گیری و حذف هرچه بیشتر متغیرهای غیرقابل کنترل است. در متروژی، کالیبراسیون به‌عنوان مجموعه کاملی از عملیات تعریف می‌شود که تحت شرایط مشخص، رابطه بین مقادیر کمیت‌های نشان داده‌شده توسط یک ابزار اندازه‌گیری یا سیستم اندازه‌گیری یا مقادیری که توسط یک استاندارد مرجع قابل ردیابی بین‌المللی نشان داده می‌شوند را برقرار می‌کند.
ردیابی با استفاده از استانداردهای مرجع قابل ردیابی بین‌المللی و بیان مقادیر کالیبراسیون در واحدهای SI تضمین می‌شود، اما همچنین با محاسبه عدم قطعیت یک کالیبراسیون و این واقعیت که کالیبراسیون‌ها فقط توسط مهندسین کالیبراسیون فنی و مجرب انجام می‌شوند. عدم قطعیت باید به کوچک‌ترین حد ممکن تکنیکی برسد. تنها در صورتی که الزامات بالا برآورده شوند، کالیبراسیون به‌طور کامل به ITS-90 (استاندارد دمای بین‌المللی) قابل ردیابی تلقی می‌شود. برای مطابقت با استاندارد ISO 10725، نیازهای اضافی باید برآورده شوند. هر آزمایشگاه تست PCR که تحت استاندارد ISO 17025 یا ISO 15189 تأیید شده است یا هر تولید کننده کیت PCR CE-IVD که تحت استاندارد ISO 13485 تأیید شده است، باید مطابق با این استانداردهای بین‌المللی ترموسایکلرهای خود را به روشی قابل ردیابی کالیبره کند و بنابراین با ISO 17025 مطابقت داشته باشد.
مطمئن‌ترین روش کالیبراسیون یک ترموسایکلر
برای اینکه یک کالیبراسیون مطمئن، مطابق با ISO 17025 و نمایانگر فرآیند PCR باشد، باید تعدادی معیار برآورده شوند. کالیبراسیون باید (1) تمام ویژگی‌های حرارتی که بر نتیجه PCR تأثیر می‌گذارند، شامل دقت، یکنواختی، نوسان دما، نرخ گرم/سرد شدن و زمان نگهداری را اندازه‌گیری کند، (2) به‌صورت دینامیک انجام شود، زیرا PCR یک فرآیند دینامیک است و نه استاتیک، (3) به‌صورت همزمان با چند کانال انجام شود تا هرگونه اثر زمانی بین چاهک‌ها حذف شود، (4) تحت شرایط محیطی کنترل‌شده انجام شود، (5) توسط پرسنل مجرب و آموزش‌دیده انجام شود و (6) به ITS-90 قابل ردیابی باشد و مقادیر کالیبراسیون را در واحدهای SI با عدم قطعیت محاسبه‌شده بیان کند. برای برآورده کردن این معیارها، سیستم کالیبراسیون ترموسایکلر باید یک سیستم فیزیکی مبتنی بر حسگر چندکاناله باشد که به‌صورت دینامیک با فرکانس بیش از یک بار در ثانیه اندازه‌گیری کند و بتواند به ITS-90 از طریق یک استاندارد مرجع دما کالیبره شود. برای به حداقل رساندن عدم قطعیت اندازه‌گیری، تأثیر متغیرهای ضعیف کنترل‌شده مانند لوله‌های واکنش و درب‌های گرم‌کن ترموسایکلر حذف می‌شود. با کالیبراسیون با تجهیزات کالیبره شده به‌طور قابل ردیابی، تحت شرایط محیطی تعریف‌شده، توسط پرسنل مجرب، مستقیماً در بلوک، در تعداد آماری مهمی از چاهک‌ها، می‌توان به عدم قطعیت کل اندازه‌گیری تا 0.1 درجه سانتی‌گراد برای یک سیستم چندکاناله دست یافت. این امکان را می‌دهد تا بیانیه‌ای از اطمینان در مورد مقدار اندازه‌گیری شده ارائه شود و امکان مقایسه با مشخصات، چه آزمایشگاهی تعریف‌شده و چه توسط سازنده تعریف‌شده، فراهم شود.
۱. کالیبراسیون دمایی:
این مهم‌ترین بخش کالیبراسیون برای یک ترموسایکلر است. دقت دمایی برای انجام واکنش‌های PCR با کیفیت بسیار مهم است. کالیبراسیون دمایی شامل موارد زیر است:
- چک کردن دماهای مرجع: دماسنج‌های معتبر برای مقایسه دمای نمایش داده شده توسط دستگاه با دمای واقعی استفاده می‌شوند.
- تست یکنواختی دما: تست می‌کند که دما در تمام نقاط بلوک حرارتی یکسان است. این برای اطمینان از یکنواختی شرایط PCR در تمامی چاهک‌ها ضروری است.
۲. کالیبراسیون سنسورهای دما:
سنسورهای دما باید به طور دوره‌ای با استفاده از معیارهای دقیق مورد بازبینی قرار گیرند تا اطمینان حاصل شود که دماها به درستی اندازه‌گیری می‌شوند.
۳. تست عملکردی:
این تست‌ها برای ارزیابی کارکرد کلی دستگاه انجام می‌شوند، از جمله:
- تست دقت زمانی: بررسی می‌کند که دستگاه در زمان‌های تعیین شده دقیقاً دما را تغییر می‌دهد.
- تست واکنش‌های کنترلی: استفاده از نمونه‌های کنترلی برای بررسی دقت و تکرارپذیری نتایج PCR.
۴. نگهداری و تمیز کردن:
- تمیز کردن بلوک‌ها و سنسورها: برای جلوگیری از آلودگی نمونه‌ها و تضمین عملکرد دقیق سنسورها، باید بلوک‌های حرارتی و سنسورهای دستگاه به طور منظم تمیز شوند. کالیبراسیون ترموسایکلرهای تولید شده توسط شرکت‌های مختلف مانند ABI (Applied Biosystems), Bio-Rad, و Eppendorf ممکن است در جزئیات خاصی متفاوت باشد، اما اصول کلی کالیبراسیون در بسیاری از موارد مشابه است. هر شرکت ممکن است دستورالعمل‌ها، تجهیزات مورد نیاز، و فرکانس کالیبراسیون را متفاوت تعیین کند بر اساس طراحی خاص دستگاه‌های خود. در اینجا به برخی از تفاوت‌ها و شباهت‌ها در روند کالیبراسیون این سه برند اشاره می‌کنیم:
کالیبراسیون دوره‌ای این دستگاه‌ها باید به طور منظم بر اساس دستورالعمل‌های تولیدکننده و استانداردهای موجود در آزمایشگاه‌ها انجام شود تا از کارایی بالا و نتایج قابل اعتماد در تمامی آزمایش‌های PCR اطمینان حاصل شود. برای انجام خدمات کالیبراسیون شماره تماس خود را گذاشته و یا در فرم مورد نظر اطلاعات خود را وارد نمایید، همکاران ما در ماناتک در اسرع وقت با شما تماس خواهند گرفت.
