نکاتی که باید برای خرید مسترمیکس Mastermix SYBR qPCR در نظر داشت

(qPCR) Master Mixes

معرفی

• واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی که به آن (Real-Time PCR qPCR) نیز گفته می‌شود، یکی از با ارزش‌ترین تکنیک‌ها است که برای تکثیر و اندازه‌گیری همزمان قطعات DNA هدف استفاده می‌شود.
• در ترکیب با رونویسی معکوس(RT) که در آن RNA به cDNA رونویسی می شود، RT-qPCR یک ابزار مهم برای تجزیه و تحلیل بیان ژن های فردی است.
• تشخیص محصولات ریل تایم PCR با گنجاندن یک مولکول فلورسنت در واکنش امکان پذیر می شود که افزایش مقدار DNA با افزایش متناسب در سیگنال فلورسانس را گزارش می کند. شیمی های فلورسنت مورد استفاده برای این منظور شامل رنگ های متصل شونده به DNA “غیر اختصاصی و پروب های توالی خاص نشاندار” شده با فلورسنت است که در ترموسایکلرهای حرارتی تخصصی مجهز به ماژول های تشخیص فلورسانس برای نظارت بر فلورسانس در طی PCR استفاده می شود.
•  شدت فلورسانس اندازه گیری شده میزان محصول تقویت شده در هر چرخه را منعکس می کند. عامل کلیدی برای موفقیت آمیز بودن qPCR، در دسترس بودن مخلو­ط­ های واکنشی است که امکان تکثیر DNA را در حضور رنگ متصل شونده به DNA یا پروب فلورسنت فراهم می کند.
• یکی از اجزای مهم مخلوط qPCR Master Mixes آنتی بادی مونوکلونال ضد Taq است که فعالیت آنزیمی DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت را غیرفعال می کند. آنزیم پس از دناتوره شدن آنتی بادی در اولین مرحله دناتوراسیون چرخه PCR دوباره فعال می شود. این به اصطلاح “Hot Start PCR” گفته می شود و تشکیل محصولات غیر اختصاصی PCR را کاهش می دهد.

اما توضیحات محصول

qPCR 2x SYBR Master Mix به qPCR با تعیین کمیت آمپلیکون های DNA با رنگ فلورسنت DNA SYBR Green I اختصاص دارد.

SYBR Green (سایبرگرین)

مخلوط حاوی رنگ DNA فلورسنت SYBR Green I است که پس از اتصال به DNA دو رشته ای (dS ) با حداکثر تحریک در 497 نانومتر (نور آبی) و گسیل در 520 نانومتر (نور سبز) به شدت منتشر می شود. از آنجایی که فلورسانس SYBR Green I غیر متصل بسیار کم است، افزایش فلورسانس در طول qPCR با افزایش آمپلیکون های dsDNA تولید شده در طی PCR مطابقت دارد.

Hot Start

qPCR 2x SYBR Master Mix حاوی آنتی بادی مونوکلونال ضد TaqDNA پلیمراز است که فعالیت آنزیمی آنزیم را غیرفعال می کند. پس از اولین چرخه دناتوراسیون، آنتی بادی به طور غیرقابل برگشت غیرفعال می شود و Taq DNA پلیمراز فعالیت آنزیمی را دوباره به دست می آورد.

آماده سازی سریع نمونه ها

تمام اجزای qPCR 2x SYBR Master Mix 2x غلیظ هستند که آماده‌سازی سریع نمونه‌های PCR را تسهیل می‌کند. نمونه ها با مخلوط کردن مقدار کمی از مسترمیکس با پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی، DNA نمونه وH2O تهیه می شوند.

ترکیبات مسترمیکس qPCR

20 mM Tris-HCl

pH 8. 8 (at 25oC)

100 mM KCl, 0.2% Triton X-100

3 mM MgCl2, 400 µM dATP

400 µM dCTP

400 µM dGTP

400 µM dTTP

50 U/ml Taq DNA polymerase

monoclonal antibody anti-Taq (38 nM)

SYBR Green I

stabilizers and additives

ذخیره سازی

بهترین دما (° 20C- تا 5±) برای نگهداری از این محصول است اما می شود تا مدت کوتاهی در دمای 10+ °C نگهداری کرد، (بهتر است تمام فرآیند انجام آزمایش روی یخ انجام شده باشد)

خلوص و کنترل کیفیت

بهتر است کیفیت DNA پلیمراز توسط SDS PAGE تایید شود، تنها یک باند 94 کیلو دالتون (به طور معمول) در ژل رنگ آمیزی آبی کوماسی مشاهده می شود (ماده فاقد نوکلئاز است).

رنگ های مورد استفاده در Master Mix qPCR

رنگ ROX یک رنگ فلورسنت بی اثر است که می تواند به عنوان یکی از اجزای یک مسترمیکس qPCR اضافه شود. بر خلاف رنگ های  Reporterمانند رنگ SYBR™ Green یا FAM™، فلورسانس رنگ ROX تحت تأثیر تقویت محصول PCR قرار نمی گیرد. به عبارت دیگر، سیگنال فلورسنت ROX در طول فرآیند qPCR ثابت می‌ماند و به مقدار قالب در واکنش ارتباطی ندارد.

چرا از ROX در qPCR استفاده می شود؟

از آنجایی که ROX یک رنگ فلورسنت غیرفعال است، دلیل اصلی استفاده از آن در qPCR برای عادی سازی سیگنال است. تغییرات جزئی بین چاهک ها می تواند بر سیگنال فلورسنت تولید شده در qPCR تأثیر بگذارد. به عنوان مثال، تفاوت در حجم واکنش به دلیل خطاهای پیپتینگ می تواند نتایج را تغییر دهد. همچنین، مسائل مرتبط با ابزار qPCR، مانند اپتیک، نیز می تواند بر سیگنال فلورسنت تولید شده تأثیر بگذارد.

در اینجا ما باید نسبت به انتخاب مسترمیکس مدنظر با توجه به مدل و برند دستگاه آگاه باشیم، برخی از دستگاه ها نیازی به ROX ندارند و برخی دیگر دارند، برای مثال:

نکات مربوط به ROX

• تفاوت بین ROX کم و ROX زیاد چیست؟

درqPCR  به طور عمومی| در دستگاه‌های “ROX کم”، شما بهینه‌سازی برانگیختگی رنگدانه ROX در ~575 نانومتر را دریافت می‌کنید و بنابراین یک سیگنال ROX قوی دارید. در دستگاه‌هایی که نیاز به “ROX زیاد” دارند، برانگیختگی رنگدانه ROX در ~488 نانومتر منجر به یک سیگنال ROX ضعیف می‌شود که می‌توان با استفاده از غلظت بالای ROX آن را برطرف کرد.

• NO ROX چیست؟

qPCR Master Mix (No ROX) را می توان مستقیماً برای PCR کمی، قوی، با حساسیت زیاد و قابلیت اطمینان بالا استفاده کرد. هیچ رنگ مرجع ROX برای استفاده با ابزارهایی که برای تصحیح خطای سیگنال های فلورسانس بین چاهک های مختلف نیازی به رنگ مرجع ندارند، گنجانده نشده است.

رنگ اواگرین (Eva Green)

• از نظر طیفی شبیه به FAM یا SYBR Green  است یعنی زمانی که از مستر میکس حاوی اوا گرین استفاده می کنیم، هیچ تغییری در تنظیمات نوری لازم نیست انجام گیرد.
• با محیط زیست سازگاری دارد و ایمن تر است.
• پایداری بیشتری نسبت به سایبر گرین دارد و به دنبال چرخه های متعدد انجماد و ذوب، مقاومت بیشتری در برابر تخریب از خود نشان می دهد.
• مهار PCR بسیار کمتری نسبت به سایبر گرین دارد.
• از اتصال پرایمر های غیر اختصاصی و ایجاد دایمر پرایمر در دمای آنالینگ جلوگیری می کند.
• اما از لحاظ قیمت از سایبر گرین بسیار گران تر است.

میزان هزینه برای خرید

به طور معمول برای خرید این محصول از 3 تا 14 دلار می توانید هزینه کنید (با توجه به نوسانات ارزی)

حالا با دانستن این اطلاعات می توانید با خیالی راحت مسترمیکس مد نظر خودتان را تهیه کنید.