متیلاسیون
متیلاسیون یک فرآیند شیمیایی است که در آن گروه متیل (-CH3) به یک مولکول اضافه می شود. این فرآیند می تواند در طبیعت به صورت طبیعی اتفاق بیفتد یا با استفاده از روش های شیمی آزمایشگاهی انجام شود. در بسیاری از موارد، متیلاسیون می تواند به عنوان یک روش برای بهبود ویژگی‌های شیمیایی یا فیزیکی یک ترکیب مورد استفاده قرار گیرد. به عنوان مثال، متیلاسیون می‌تواند در تولید بنزن، آمفتامین و یا متیل‌ترت-بوتیل اتر استفاده شود.
در علم ژنتیک و بیولوژی مولکولی، دو نوع متیلاسیون وجود دارد:
متیلاسیون DNA
در این نوع متیلاسیون، گروه متیل (-CH3) به کربن ۵ سایتوزین (C) در DNA اضافه می‌شود. این نوع متیلاسیون در نواحی خاصی از DNA مانند جزء CpG رخ می‌دهد و در بسیاری از ارگانیسم‌ها، عملکرد مهمی در تنظیم بیان ژن‌ها و تحریک و یا نهان کردن ژن‌ها دارد.
متیلاسیون هیستون
در این نوع متیلاسیون، گروه متیل به یک یا چند لیزین در پروتئین هیستون اضافه می‌شود. هیستون‌ها یکی از عواملی هستند که در پیچیدگی ساختاری DNA و تنظیم بیان ژن‌ها نقش دارند. متیلاسیون هیستون می‌تواند تأثیرات بزرگی بر روی عملکرد هیستون ها داشته باشد و می تواند به عنوان نشانگری برای تغییراتی که در بیان ژن ها ایجاد می شود، استفاده شود.
در کل، هر دو نوع متیلاسیون DNA و هیستون می توانند به تنظیم بیان ژن‌ها و تحریک و یا نهان کردن ژن‌ها کمک کنند و در بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی از جمله توسعه جنینی، تکامل و بیماری های مختلف نقش دارند.
تکنیک متیلاسیون DNA
یک روش برای بررسی الگوی متیلاسیون در DNA است که به کمک آن می‌توان الگوی متیلاسیون در ناحیه‌های مشخصی از DNA را تشخیص داد. این تکنیک به عنوان یکی از روش‌های تحقیقاتی در زمینه بررسی تغییرات اپی ژنتیکی در DNA مورد استفاده قرار می‌گیرد.
برای انجام تکنیک متیلاسیون DNA، ابتدا DNA نمونه مورد نظر استخراج می‌شود. سپس با استفاده از یک آنزیم خاص به نام متیل‌سیتوزین، آزادسازی شده و به یک ماده شیمیایی به نام بیسولفیت نمونه اضافه می‌شود. بیسولفیت باعث تبدیل متیل‌سیتوزین به یوراسیل می‌شود، اما متیل سیتوزین هایی که قبلاً متیله شده‌اند، تبدیل نمی‌شوند و به صورت متیله باقی می‌مانند.
سپس با استفاده از روش‌های مختلف، میزان متیلاسیون در نمونه مورد نظر تعیین می‌شود. از جمله روش‌هایی که برای تعیین متیلاسیون استفاده می‌شود، می‌توان به PCR (Polymerase Chain Reaction) و DNA Methylation Microarrays اشاره کرد.
با استفاده از تکنیک متیلاسیون DNA، می‌توان به بررسی تغییرات متیلاسیون در DNA در پژوهش‌های مختلفی از جمله ژنتیک، بیماری‌شناسی، بررسی رفتار سلولی، و دیگر حوزه‌های پزشکی و بیولوژی کمک کرد.
کاربرد تکنیک متیلاسیون DNA در بررسی سرطان ها
تکنیک متیلاسیون DNA در بررسی تغییرات متیلاسیون در سلول‌های سرطانی به کار می‌رود. در بسیاری از انواع سرطان، تغییرات متیلاسیون در DNA اتفاق می‌افتد که باعث تغییراتی در فعالیت ژن‌های مختلف می‌شود. بررسی این تغییرات متیلاسیون در سلول‌های سرطانی می‌تواند به شناسایی شاخص‌های بیماری، تشخیص زودهنگام، پیش‌بینی پاسخ به درمان و همچنین تعیین پرونگوزیس بیماری کمک کند. به عنوان مثال، در برخی از انواع سرطان، تغییرات متیلاسیون در ناحیه‌هایی از DNA که با ژن‌های Super-Suppressor Genes مرتبط هستند، مشاهده شده است. این ژن‌ها نقش مهمی در کنترل رشد و تقسیم سلولی سلول‌ها دارند. بررسی تغییرات متیلاسیون در نواحی مرتبط با این ژن‌ها، می‌تواند به شناسایی بیماری‌های مختلف کمک کند.
در کل، تکنیک متیلاسیون DNA به عنوان یکی از روش‌های مهم در بررسی تغییرات متیلاسیون در سلول‌های سرطانی و همچنین در بسیاری از حوزه‌های پژوهشی دیگر از جمله بیولوژی سلولی و علوم پزشکی، استفاده می‌شود و برای شناسایی متیلاسیون در DNA، روش‌های مختلفی می‌توان استفاده کرد که شامل روش‌های مولکولی و غیرمولکولی است.
بررسی روش‌های تحلیلی مولکولی:
امروزه، روش‌های مختلف مولکولی برای شناسایی متیلاسیون در DNA وجود دارد. برخی از این روش‌ها شامل: بررسی تغییرات پایه‌های DNA با استفاده از فناوری PCR (Polymerase Chain Reaction) و بررسی تغییرات در توالی DNA با استفاده از روش‌های برچسب‌گذاری، نظیر Bisulfite Sequencing و Methylation-Sensitive Restriction Enzyme Digestion. استفاده از روش‌های مبتنی بر آرایه، نظیر Methylation-Specific Oligonucleotide Microarray هستند.
بررسی متیلاسیون با استفاده از روش‌های تصویربرداری: روش‌های تصویربرداری مانند Immunohistochemistry و Immunofluorescence می‌توانند برای شناسایی متیلاسیون در بافت‌های زنده و بیماری‌های مرتبط با آن، مفید باشند. در کل، شناسایی متیلاسیون در DNA می‌تواند با استفاده از روش‌های مختلف مولکولی و غیرمولکولی انجام شود. هر یک از این روش‌ها، مزایا و محدودیت‌های خود را دارند و انتخاب روش مناسب باید با توجه به هدف تحقیق و شرایط آزمایش تعیین شود.
محدودیت های روش های مولکولی در شناسایی متیلاسیون DNA
روش های مولکولی برای شناسایی متیلاسیون در DNA می‌توانند دارای محدودیت‌هایی باشند که باید در نظر گرفته شوند. برخی از این محدودیت‌ها عبارتند از:
بیشتر بخوانید:چالش‌های آینده در تشخیص غیر تهاجمی پیش از تولد (NIPT)
خطای ممکن در روش‌های PCR: در روش‌های PCR، وجود خطاهای ممکن به دلیل تغییرات در توالی DNA و مشکلات فنی مانند خطاهای پرایمر، خطاهای توالی و خطاهای کپی می‌تواند به نتایج نادرست منجر شود.
مشکل در تشخیص متیلاسیون جزء CpG نامشخص: در برخی از ناحیه‌های DNA، وجود چندین پایه CpG نامشخص باعث می‌شود که تشخیص متیلاسیون در این نواحی با مشکل مواجه شود.
مشکلات در تشخیص متیلاسیون دقیق: برخی از روش‌های مولکولی مانند Bisulfite Sequencing، در تشخیص متیلاسیون دقیقی که در نزدیکی سایت‌های CpG وجود دارند، مشکل دارند.
مشکل در تشخیص متیلاسیون همزمان در تمام سلول‌ها: در برخی موارد، ممکن است متیلاسیون در تعداد کمی از سلول‌ها رخ داده باشد، در صورتی که در بررسی تمام سلول‌ها تشخیص داده نشود. این مسئله می‌تواند به نتایج نادرست منجر شود.
محدودیت‌های فنی: ممکن است محدودیت‌های فنی مانند محدودیت‌های در دسترسی به تعداد کافی از نمونه‌های بافتی، مشکلات در استخراج DNA و مشکلات در توالی‌دهی باعث محدودیت در استفاده از روش‌های مولکولی شوند.
در کل، برای استفاده از روش‌های مولکولی در شناسایی متیلاسیون در DNA، باید محدودیت‌های مختلف را در نظر گرفت و روش‌هایی را انتخاب کرد که بهترین نتایج را در شرایط مورد نظر ارائه می‌دهند و برای انجام متیلاسیون، نیازمند ترکیبی از تکنیک‌های مولکولی مانند PCR و توالی یابی و دستگاه‌های مربوط به آن‌ها هستید. همچنین، برای استفاده از روش‌های مختلف، باید به دانش و تجربه کافی در زمینه بیوشیمی و مولکولی برخوردار باشید.
محدودیت در تشخیص متیلاسیون:
تکنیک‌های متیلاسیون فقط به تعداد محدودی از سایت‌های CpG محدود می‌شوند که به وسیله اندونوکلئازهای اختصاصی متیلاسیون قابل تشخیص هستند. در نتیجه، تشخیص وضعیت متیلاسیون در جایگاه‌های CpG اختصاصی خیلی مفید نیست.
نیاز به DNA با کیفیت بالا: تکنیک‌های متیلاسیون به مقدار زیادی DNA با کیفیت نیاز دارند که باید با روش PCR این مشکل را رفع کرد. با این حال، استفاده از PCR می‌تواند منجر به تغییر وضعیت متیلاسیون سیتوزین به سیتوزین غیرمتیله شود.
طراحی پرایمرهای اختصاصی: پرایمرهای اختصاصی باید به گونه‌ای طراحی شوند که اختصاصی نواحی بالادست و پایین دست جایگاه‌های CpG اختصاصی باشند. این کار می‌تواند باعث شود که تعداد محدودی از جایگاه‌های CpG قابل تشخیص باشند.
احتمال تولید نتایج کاذب: برای اینکه نتایج تکنیک‌های متیلاسیون صحیح باشند، باید به دقت از تجهیزات و روش‌های صحیح استفاده کرد. همچنین، وجود نقص در برش در مقادیر اندک نیز می‌تواند منجر به تولید نتایج کاذب مثبت شود.
محدودیت در بررسی بافت: برای بررسی متیلاسیون در بافت به طور اختصاصی، نیازمند استفاده از تکنیک‌های وابسته به هیبریداسیون in situ و آنتی بادی‌های آنتی-متیل سیتوزین لیبل شده هستیم. این تکنیک‌ها محدودیت‌های خود را دارند و نمی‌توانند برای آنالیزهای متیلاسیونی کل ژنوم مناسب باشند.
کلام آخر:
ما در این مقاله برآن شدیم تا انواع متیلاسیون و به ویژه متیلاسیون DNA و کاربرد تکنیک های مولکولی و محدودیت های مربوطه در این فرایند را ذکر کنیم. برای خرید انواع دستگاه ترموسایکلر PCR و ریل تایم PCR با کارشناسان متخصص ما در ماناتک تماس حاصل فرمایید.
