تکنیک Multiplex NGS+مزایا و کاربردها

مقدمه‌ای بر مولتی‌پلکس سکوئنسینگ

توالی‌یابی نسل جدید (NGS) به عنوان یک تکنیک انقلابی در زیست‌شناسی مولکولی شناخته می‌شود که امکان تولید حجم عظیمی از داده‌های توالی DNA را فراهم کرده است. مولتی‌پلکس سکوئنسینگ یکی از روش‌های کلیدی در NGS است که به محققان اجازه می‌دهد تا چندین نمونه را به طور همزمان توالی‌یابی کنند. این تکنیک با افزودن برچسب‌های منحصر به فرد (بارکد) به هر نمونه، امکان تشخیص و تفکیک توالی‌های مختلف را فراهم می‌کند.

Multiplex NGS (Next Generation Sequencing) یک روش پیشرفته در بیوتکنولوژی و ژنتیک است که اجازه می‌دهد تعداد زیادی از نمونه‌های DNA یا RNA را به صورت همزمان تجزیه و تحلیل کنیم. این فناوری بر پایه‌ی تکنیک‌های سکوانسینگ نسل جدید استوار است، اما با افزودن قابلیت مالتی‌پلکس، کارایی آن را به شدت افزایش می‌دهد. مولتی‌پلکس سکوئنسینگ (Multiplex Sequencing) در تکنیک‌های نسل جدید توالی‌یابی (NGS) یک روش بسیار قدرتمند است. این روش به محققان اجازه می‌دهد تا هزینه‌ها و زمان مورد نیاز برای توالی‌یابی را به‌طور قابل توجهی کاهش دهند و بهره‌وری را افزایش دهند.در ادامه، به مزایا و کاربردهای multiplex NGS می‌پردازیم.

مزایای Multiplex NGS

1. کارایی بالا: با استفاده از بارکدهای مختص هر نمونه، می‌توان چندین نمونه را در یک ران سکوانسینگ قرار داد. این امر باعث صرفه‌جویی در زمان و هزینه می‌شود.
2. دقت بالا: تکنیک‌های پیشرفته‌ی سکوانسینگ و تجزیه و تحلیل داده‌ها امکان شناسایی جهش‌ها و تغییرات ژنتیکی را با دقت بسیار بالا فراهم می‌کنند.
3. کاهش خطا: با کاهش نیاز به تکرار نمونه‌برداری و سکوانسینگ جداگانه برای هر نمونه، خطاهای ناشی از آلودگی یا اشتباه در نمونه‌برداری به حداقل می‌رسد.
4. انعطاف‌پذیری: قابلیت تطبیق با انواع مختلف پروژه‌های تحقیقاتی، از مطالعات کوچک تا بزرگ، و قابلیت تجزیه و تحلیل نمونه‌های متنوع.

کاربردهای Multiplex NGS

1. پزشکی دقیق: در درمان‌های مبتنی بر ژنتیک، مانند شناسایی نشانگرهای بیماری‌های خاص یا جهش‌های مرتبط با پاسخ به داروها.
2. تحقیقات سرطان: شناسایی پروفایل‌های ژنتیکی تومورها برای درک بهتر مکانیسم‌های بیماری و توسعه درمان‌های هدفمند.
3. بررسی‌های جمعیتی: تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی در جمعیت‌های بزرگ برای مطالعات اپیدمیولوژی و تکاملی.
4. زیست‌شناسی محافظتی: مطالعه تنوع ژنتیکی در گونه‌های در معرض خطر انقراض برای حفاظت بهتر و برنامه‌ریزی حفاظتی.

فرآیند

مولتی‌پلکس سکوئنسینگ شامل چندین مرحله کلیدی است:

1. آماده‌سازی نمونه‌ها: نمونه‌های DNA یا RNA از منابع مختلف جمع‌آوری و آماده‌سازی می‌شوند.
2. برچسب سازی: برچسب‌های منحصر به فرد (بارکد) به هر نمونه افزوده می‌شود تا هر توالی به‌طور مشخص قابل شناسایی باشد.
3. توالی‌یابی: نمونه‌ها به‌طور همزمان توالی‌یابی می‌شوند.
4. تحلیل داده‌ها: داده‌های تولید شده از توالی‌یابی تحلیل می‌شوند تا توالی‌های مربوط به هر نمونه مجزا شناسایی و بررسی شوند.

چالش‌ها

• با وجود مزایای متعدد، مولتی‌پلکس سکوئنسینگ با چالش‌هایی نیز مواجه است:
  • خطاهای توالی‌یابی: افزایش تعداد نمونه‌ها ممکن است منجر به افزایش خطاهای توالی‌یابی شود. برای کاهش این خطاها، نیاز به طراحی دقیق بارکدها و استفاده از الگوریتم‌های پیشرفته بیوانفورماتیک است.
  • تحلیل داده‌ها: تحلیل داده‌های حاصل از مولتی‌پلکس سکوئنسینگ به توان محاسباتی بالایی نیاز دارد. پردازش و تفسیر داده‌های بزرگ می‌تواند زمان‌بر و پیچیده باشد.
  • آماده‌سازی نمونه‌ها: مراحل آماده‌سازی و برچسب‌گذاری نمونه‌ها نیازمند دقت و مهارت بالاست. خطا در این مراحل می‌تواند منجر به نتایج نادرست شود.

توسعه روش‌های تشخیصی

Multiplex NGS امکان تشخیص همزمان چندین پاتوژن یا شرایط ژنتیکی را فراهم می‌آورد. این خصوصیت در مواردی که نشانگرهای ژنتیکی متعدد باید برای تشخیص دقیق بررسی شوند، مثلاً در بیماری‌های چندعاملی مانند دیابت، بیماری‌های قلبی و اختلالات ایمنی، بسیار مفید است. استفاده از این تکنولوژی می‌تواند به پزشکان کمک کند تا تشخیص‌های دقیق‌تری ارائه دهند و درمان‌های شخصی‌سازی‌شده‌تری برای بیماران خود توسعه دهند.

کاربردها در بیوانفورماتیک

Multiplex NGS نیازمند پیشرفت‌های قابل توجهی در زمینه‌ی بیوانفورماتیک است تا بتواند داده‌های حاصل از سکوانسینگ را مدیریت، تجزیه و تحلیل کند. نرم‌افزارها و ابزارهای بیوانفورماتیکی که برای پردازش داده‌های Multiplex NGS توسعه یافته‌اند، این قابلیت را دارند که با دقت بسیار بالا، اطلاعات ژنتیکی مربوط به هر نمونه را از دیگری متمایز کنند. این امر اطمینان می‌دهد که داده‌ها با بالاترین سطح دقت ممکن تجزیه و تحلیل شوند.

اهمیت در تحقیقات میکروبیوم

در تحقیقات میکروبیوم، جایی که تنوع بسیار زیادی از میکروب‌ها در یک نمونه وجود دارد، استفاده از Multiplex NGS می‌تواند اطلاعات قابل توجهی را در مورد ترکیب جامعه میکروبی ارائه دهد. این روش امکان بررسی تأثیر میکروب‌ها بر سلامت انسان، محیط زیست و دیگر بیوسیستم‌ها را می‌دهد، و درک ما از نقش میکروبیوم‌ها را در بیماری‌ها و فرآیندهای بیولوژیکی گسترش می‌دهد.

کاربرد در کشاورزی و زراعت

در زمینه‌های کشاورزی و به‌نژادی، Multiplex NGS می‌تواند به توسعه گونه‌های گیاهی و دامی با ویژگی‌های بهبودیافته کمک کند. توانایی تجزیه و تحلیل همزمان چندین نمونه یا ژنوم باعث شده است که بتوان به سرعت جهش‌ها و تنوع ژنتیکی مورد نیاز برای بهبود مقاومت به بیماری‌ها، بهینه‌سازی رشد و افزایش محصول دهی را شناسایی کرد.

Multiplex NGS نه تنها به پیشبرد دانش علمی کمک کرده است بلکه در عمل نیز تأثیرات مثبتی بر جوامع و صنایع مختلف داشته است. با توجه به پیشرفت‌های فناوری و کاهش هزینه‌های مرتبط، انتظار می‌رود که این تکنولوژی در آینده نقش هرچه بیشتری در زمینه‌های علمی و پزشکی ایفا کند.

چند مفهوم کلیدی وجود دارد که در طراحی و اجرای یک آزمایش Multiplex NGS اهمیت دارند:

1. بارکدینگ: این روش شامل افزودن توالی‌های کوتاه و منحصربه‌فرد DNA به هر نمونه است که به عنوان بارکدها عمل می‌کنند. این بارکدها امکان تفکیک داده‌های حاصل از هر نمونه را پس از سکوانسینگ می‌دهند.
2. Library Preparation: تهیه کتابخانه شامل آماده‌سازی نمونه‌های DNA یا RNA برای سکوانسینگ است. در Multiplexing، نمونه‌های مختلف با بارکدهای متفاوت ترکیب شده و به صورت همزمان آماده می‌شوند.
3. Pooling: ترکیب کردن نمونه‌های بارکد شده به نسبت‌های مشخص برای اطمینان از اینکه هر نمونه به طور موثری در داده‌های سکوانسینگ نمایندگی می‌شود. این نسبت‌ها باید دقیقاً محاسبه شوند تا از تعادل مناسب در کتابخانه سکوانسینگ اطمینان حاصل شود.
4. Sequencing Depth: عمق سکوانسینگ، که به تعداد بارهای خواندن هر نمونه در طی سکوانسینگ اشاره دارد، باید کافی باشد تا تمام توالی‌های مورد نظر را با دقت بالا پوشش دهد. این عمق بسته به هدف آزمایش و تعداد نمونه‌ها تنظیم می‌شود.

پیشرفت‌های اخیر در مولتی‌پلکس سکوئنسینگ

پیشرفت‌های فناوری در سال‌های اخیر به بهبود کارایی و دقت مولتی‌پلکس سکوئنسینگ کمک کرده است. برخی از این پیشرفت‌ها عبارتند از:

1. بهبود تکنیک‌های بارکدگذاری: استفاده از بارکدهای پیچیده‌تر و بهینه‌سازی طراحی آنها باعث افزایش دقت و کاهش خطاهای توالی‌یابی شده است.
2. افزایش ظرفیت توالی‌یابی: توسعه دستگاه‌های نسل جدید توالی‌یابی با ظرفیت بالاتر امکان توالی‌یابی همزمان تعداد بیشتری از نمونه‌ها را فراهم کرده است.
3. تکنیک‌های جدید آنالیز داده‌ها: توسعه الگوریتم‌های پیشرفته بیوانفورماتیک برای تحلیل داده‌های مولتی‌پلکس سکوئنسینگ به بهبود دقت و کارایی تحلیل‌ها کمک کرده است.

کاربردهای خاص

مولتی‌پلکس سکوئنسینگ در چندین حوزه تخصصی نیز به کار می‌رود:

1. پزشکی دقیق: در پزشکی دقیق، مولتی‌پلکس سکوئنسینگ به تشخیص بیماری‌ها و تعیین درمان‌های شخصی‌سازی شده بر اساس پروفایل ژنتیکی بیماران کمک می‌کند.
2. اپیدمیولوژی ژنتیکی: این تکنیک در مطالعات اپیدمیولوژیک برای بررسی شیوع و توزیع ژن‌های مرتبط با بیماری‌ها در جمعیت‌های مختلف استفاده می‌شود.
3. توالی‌یابی ویروس‌ها و باکتری‌ها: در مطالعات بیماری‌های عفونی، مولتی‌پلکس سکوئنسینگ برای شناسایی و ردیابی ویروس‌ها و باکتری‌های بیماری‌زا به کار می‌رود.

فرمول محاسبه‌ای

درک فرمول محاسبه‌ای که ذکر کردید، به درک رابطه بین توان عملیاتی (Operational Efficiency)، پوشش توالی (Sequencing Depth)، و تعداد امپلیکون‌های هدف (Number of Target Amplicons) در یک آزمایش Multiplex NGS می‌پردازد. این فرمول می‌تواند به صورت زیر توضیح داده شود:

توضیحات فرمول:

1. توان عملیاتی (Operational Efficiency): این عامل نشان‌دهنده کارآیی کلی آزمایش است و می‌تواند شامل میزان موفقیت در تکثیر نمونه‌ها، دقت بارکدگذاری و توانایی مجموعه‌سازی کتابخانه‌ها باشد.
2. پوشش توالی (Sequencing Depth): این مقدار بیانگر تعداد دفعاتی است که یک ناحیه ژنتیکی خاص در طول فرآیند سکوانسینگ خوانده می‌شود. پوشش بالا نشان‌دهنده دقت بیشتر در تعیین توالی است.
3. تعداد امپلیکون‌های هدف (Number of Target Amplicons): تعداد نواحی یا توالی‌های مشخصی از DNA که در آزمایش برای تکثیر و سکوانس شدن هدف‌گذاری شده‌اند.

کاربرد فرمول:

این فرمول به محققین کمک می‌کند تا بفهمند که چگونه تغییر در یکی از این پارامترها (مانند افزایش تعداد امپلیکون‌ها یا پوشش توالی) می‌تواند بر کارایی کلی آزمایش تأثیر بگذارد. به عنوان مثال، افزایش تعداد امپلیکون‌های هدف ممکن است نیازمند پوشش بیشتری برای حفظ دقت باشد، که می‌تواند تأثیر منفی بر کارایی عملیاتی داشته باشد. از این فرمول می‌توان برای برنامه‌ریزی و تنظیم پارامترهای آزمایش استفاده کرد تا بهترین نتیجه ممکن حاصل شود.

بیشتر بخوانید:معرفی تکنیک توالی یابی نسل جدید (NGS)

بیماری های قابل بررسی

Multiplex NGS (Next Generation Sequencing) به دلیل قابلیت‌های فوق‌العاده‌ای که دارد، در بررسی و تشخیص بسیاری از بیماری‌ها کاربرد دارد. این تکنیک به خصوص در موارد زیر بسیار مفید است:

1. بیماری‌های ژنتیکی: برای شناسایی جهش‌ها و ناهنجاری‌های ژنتیکی که ممکن است در بیماری‌های ارثی نقش داشته باشند، مانند فیبروز کیستیک، بیماری تالاسمی، و اختلالات متابولیک مادرزادی.
2. سرطان: تشخیص و طبقه‌بندی انواع مختلف سرطان با شناسایی جهش‌های سوماتیک و ژرم‌لاین که ممکن است به درمان‌های هدفمند منجر شود. این شامل بررسی پروفایل‌های ژنتیکی تومورها مانند سرطان سینه، ریه، و روده بزرگ است.
3. عفونت‌ها: شناسایی و تفکیک سریع پاتوژن‌های متعدد در نمونه‌های کلینیکی، که می‌تواند شامل ویروس‌ها، باکتری‌ها، و قارچ‌ها باشد. این تکنیک به خصوص در مواقع شیوع بیماری‌های عفونی مانند COVID-19 مفید است.
4. بیماری‌های عصبی: شناسایی اختلالات عصبی که ممکن است دارای علل ژنتیکی باشند، مانند بیماری آلزایمر و بیماری پارکینسون.
5. بیماری‌های نادر: Multiplex NGS امکان بررسی همزمان چندین ژن را فراهم می‌کند، که این امر برای تشخیص بیماری‌های نادر که ممکن است فقط چند جهش خاص داشته باشند، بسیار مفید است.
6. بررسی پاسخ به درمان: تعیین چگونگی پاسخ بیماران به داروهای خاص بر اساس تغییرات ژنتیکی آن‌ها، که به اصطلاح فارماکوژنومیک نامیده می‌شود. این اطلاعات می‌تواند به بهینه‌سازی و شخصی‌سازی روش‌های درمانی کمک کند.

برای مطالعه بیشتر میتوانید به مقاله ذیل مراجعه کنید.

مقاله “Genotyping by Multiplexed Sequencing (GMS): A Customizable Platform for Genomic Selection”

یک روش جدید ژنوتایپینگ مبتنی بر PCR را معرفی می‌کند که امکان چندگانه‌سازی هزاران نشانگر SNP را فراهم می‌سازد. این روش از دو مرحله PCR استفاده می‌کند و برای ژنوتایپینگ دقیق و کارآمد طراحی شده است. پروتکل GMS می‌تواند با پلتفرم‌های NGS مانند Illumina و Ion Torrent سازگار باشد. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که داده‌های به‌دست‌آمده از GMS با داده‌های آزمون 90K SNP chip همخوانی کامل دارد. محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) نشانگرهای SNP در این پروتکل به‌طور متوسط 0.30 است که نشان‌دهنده کارایی بالای آن است. این مطالعه روش GMS را به عنوان یک روش ژنوتایپینگ ساده، ارزان و دقیق معرفی می‌کند که می‌تواند برای اکثر مطالعات ژنتیکی از جمله انتخاب ژنومی استفاده شود. این روش دقت بالا و تفسیرپذیری داده‌ها را تضمین می‌کند و قابلیت سفارشی‌سازی بر اساس نیازهای پژوهشی مختلف را دارد.

لینک دانلود مقاله

کلام آخر

مولتی‌پلکس سکوئنسینگ به عنوان یکی از تکنیک‌های پیشرفته در توالی‌یابی نسل جدید، امکانات بی‌نظیری را برای تحقیقات ژنتیکی و تشخیص بالینی فراهم کرده است. با ادامه پیشرفت‌های فناوری، انتظار می‌رود که این روش به‌طور گسترده‌تری در تحقیقات و کاربردهای بالینی به کار گرفته شود و به بهبود سلامت و رفاه انسان‌ها کمک کند.اجرای Multiplex NGS نیازمند درک دقیق از فناوری سکوانسینگ و دانش کافی در مورد تجزیه و تحلیل داده‌های بیوانفورماتیک است. این فرایندها بر پایه اصول بیولوژیکی و تکنیک‌های پیچیده مهندسی ژنتیک بنا شده‌اند. جهت دریافت مشاوره و کسب اطلاعات و معرفی تکنیک NGS با کارشناسان ما در ماناتک تماس حاصل فرمایید.