تکنیک مولکولی FISH

تاریخچه و معرفی

 مراحل انجام تکنیک

آماده‌سازی پروب: پروب‌ها قطعاتی از DNA هستند که مکمل توالی DNA مورد علاقه هستند. این پروب‌ها با برچسب‌های فلورسنت علامت‌گذاری می‌شوند.

آماده‌سازی نمونه: DNA در نمونه (مانند سلول‌ها روی یک اسلاید) دناتوره می‌شود، که باعث تبدیل DNA دو رشته‌ای به رشته‌های تکی می‌شود. هیبریدیزاسیون: پروب‌های فلورسنت به نمونه اعمال می‌شوند. آنها به دنبال توالی‌های مکمل DNA خود در نمونه می‌گردند و به آنها متصل می‌شوند. شستشو: پس از هیبریدیزاسیون، نمونه شسته می‌شود تا پروب‌های اضافی حذف شوند. تشخیص: تحت میکروسکوپ فلورسنت، پروب‌ها می‌درخشند، که نشان‌دهنده‌ی جایی است که به DNA نمونه متصل شده‌اند.

کاربردها

• تحقیقات ژنتیکی: برای مطالعه ناهنجاری‌های ژنتیکی، نقشه‌برداری ژن‌ها و درک اختلالات ژنتیکی استفاده می‌شود.
• تشخیص و تحقیقات سرطان: FISH می‌تواند تغییرات ژنتیکی خاص و ناهنجاری‌های کروموزومی مرتبط با انواع مختلف سرطان‌ها را شناسایی کند.
• تشخیص پیش از تولد: در تشخیص ناهنجاری‌های کروموزومی در جنین کمک می‌کند.
• بیماری‌های عفونی: برای شناسایی باکتری‌ها یا ویروس‌های خاص در یک نمونه با هدف قرار دادن توالی‌های ژنتیکی منحصر به فرد استفاده می‌شود.

مزایا

• اختصاصیت بالا: می‌تواند با دقت توالی‌های خاص DNA را روی کروموزوم‌ها مکان‌یابی کند.
• چندمنظوره بودن: قابل اعمال بر روی انواع مختلف نمونه‌ها از جمله هسته‌های در میان‌فاز و کروموزوم‌های در متافاز.
• تشخیص همزمان: قادر به تشخیص چندین هدف به طور همزمان با استفاده از برچسب‌های فلورسنت رنگارنگ است.

• FISH در مقایسه با سایر تکنیک‌ها

FISH اغلب با PCR مقایسه می‌شود. در حالی که PCR توالی‌های خاص DNA را تکثیر می‌کند، FISH برای مکان‌یابی و تصویربرداری مواد ژنتیکی درون سلول استفاده می‌شود. همچنین نسبت به تکنیک‌هایی مانند ساترن بلاتینگ، مستقیم‌تر است و اطلاعات لحظه‌ای در مورد ساختار و چینش کروموزومی ارائه می‌دهد.

متد پایه

هیبریداسیون: FISH شامل استفاده از پروب‌های DNA یا RNA با برچسب فلورسنت است که مکمل توالی‌های خاصی از ژنوم یا نسخه‌برداری‌های RNA هستند. این پروب‌ها می‌توانند به توالی‌های خاص اسید نوکلئیک درون سلول بچسبند (هیبرید شوند).

 فلورسنت میکروسکوپی: پس از اینکه پروب‌ها به توالی‌های هدف خود متصل شده‌اند، می‌توان آن‌ها را با استفاده از میکروسکوپی فلورسنت مشاهده کرد. برچسب‌های فلورسنتی در اثر تحریک نور، نوری با طول موج‌های خاصی را منتشر می‌کنند که این امکان را فراهم می‌آورد تا پروب‌ها شناسایی و موقعیت‌یابی شوند.

پروب ها

اندازه پروب در تکنیک FISH معمولاً بین ۱۰۰ تا ۵۰۰ نوکلئوتید است و بر اساس توالی هدف که میخواهیم شناسایی کنیم، طراحی میشود. پروب باید دارای خصوصیاتی از جمله: مکمل توالی هدف باشد و با آن هیبرید شود. دارای رنگ فلورسانسی مناسب باشد که با میکروسکوپ قابل تشخیص باشد. دارای تمپرچر هیبریداسیون مناسب باشد که با شرایط واکنش سازگار باشد. دارای توالی های تکراری، همترازی خودی یا همترازی با سایر پروبها نباشد که باعث اختلال در هیبریداسیون شود. برای طراحی پروب های FISH میتوان از نرم افزارها و بانک های اطلاعاتی مختلفی استفاده کرد.

همچنین مقدار پروب که باید در تکنیک FISH اضافه شود، بستگی به نوع پروب، نوع نمونه، نوع روش و هدف تست دارد. به طور کلی، مقدار پروب باید به گونه ای باشد که بتواند توالی هدف را با دقت و کارایی بالا شناسایی کند، اما در عین حال از بیش از حد بودن پروب که میتواند باعث ایجاد سیگنال های غیرمرتبط و اختلال در تفسیر نتایج شود، جلوگیری کند. برای مثال، برای تشخیص ناهنجاری های تعدادی کروموزومی، مقدار پروب معمولاً بین ۵ تا ۱۰ میکرولیتر در هر چاهک است. برای تشخیص ناهنجاری های ساختاری کروموزومی، مقدار پروب معمولاً بین ۱۰ تا ۲۰ میکرولیتر در هر چاهک است. برای تشخیص بیان ژنها، مقدار پروب معمولاً بین ۲۰ تا ۴۰ میکرولیتر در هر چاهک است. البته این مقادیر تنها به عنوان راهنمای کلی بیان شده اند و ممکن است بر اساس شرایط خاص هر آزمایش تغییر کنند.

بیشتر بخوانید:آموزش تکنیک HRM برای شناساسی ژنوتیپ و جهش ها

برای مطالعه بیشتر به مقاله ذیل مراجعه کنید

نتایج مقاله

• کاربردهای گسترده: FISH به عنوان استاندارد طلایی در تشخیص ناهنجاری‌های کروموزومی شناخته شده و در تحقیقات ژنومی و زیست‌شناسی سلولی و تشخیص‌های بالینی استفاده می‌شود.
• محدودیت‌ها: مصرف بالای پروب‌ها و زمان طولانی آزمایش از محدودیت‌های اصلی این تکنیک هستند.
• پیشرفت‌های آینده: فناوری‌های میکروفلوئیدیک می‌توانند با بهبود زمان واکنش و کاهش مصرف مواد، این محدودیت‌ها را کاهش دهند و استفاده از FISH را در تشخیص‌های روتین تسهیل کنند.

لینک دانلود مقاله

کلام آخر :

تکنیک مولکولی FISH یا هیبریداسیون درجا فلورسنت یک روش سیتوژنتیک مولکولی است که برای شناسایی و تعیین موقعیت توالی های DNA یا RNA خاص در نمونه های بیولوژیکی استفاده میشود. این روش با استفاده از پروبهای DNA یا RNA که با رنگ های فلورسانسی نشان دار شده اند و مکمل توالی های هدف هستند، انجام میشود. پروب ها با توالی های هدف هیبرید میشوند و با میکروسکوپ فلورسنت قابل تشخیص هستند. این روش برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومی، جهش های ژنتیکی، متیلاسیون DNA، بیان ژنها و غیره کاربرد دارد. برای دریافت مشاوره و خرید انواع دستگاه های مولکولی با کارشناسان ما در ماناتک تماس حاصل فرمایید.